I metaboliti immunomodulatoî en unna caratteristica ciave do microambiente do tumore (TME), ma con pöche ecceçioin, e seu identitæ arrestan pe-a ciù parte desconosciue. Chì emmo analizzou di tumoî e de çellole T da-i tumoî e da-e ascite de paçienti con carcinoma seroso de livello erto (HGSC) pe revelâ o metabòloma de sti diversci compartimenti TME. L’ascite e e çellole do tumore an de gren differense de metaboliti. In confronto à l’ascite, e çellole T ch’infiltran o tumore en scignificativamente inricchie con 1-metilnicotinamide (MNA). Sciben che o livello de MNA inte çellole T o l’é erto, l’esprescion da nicotinamide N-metiltrasferaxi (un enzima ch’o catalizza o trasferimento de gruppi metilichi da S-adenosilmetioniña a-a nicotinamide) a l’é limitâ a-i fibroblasti e a-e çellole do tumore. Fonçionalmente, o MNA o l’induxe e çellole T à secretâ a citochina ch’a promeuve o tumore, o fattô de necròxi do tumore alfa. De conseguensa, o MNA deriviou da-o TME o contribuisce a-a regolaçion immunitäia de çellole T e o representa un potençiale obiettivo d’immunoterapia pe-o trattamento do cancro de l’òmmo.
I metaboliti derivæ da-o tumore peuan avei un profondo effetto inibitô in sce l’immunitæ antitumorale e sempre ciù tante preuve mostran che peuan servî ascì comme fòrsa motrixe ciave pe-a progrescion da mouttia (1). In azzonta à l’effetto Warburg, un travaggio reçente o l’à comensou à caratterizzâ o stato metabòlico de çellole do tumore e a seu relaçion co-o stato immunitäio do microambiente do tumore (TME). Di studdi in sce di modelli de ratto e in scê çellole T de l’òmmo an demostrou che o metabolismo da glutamina (2), quello oscidativo (3) e quello do glucòsio (4) peuan agî de forma independente in sce diversci sottogruppi de çellole immunitäie. Diversci metaboliti inte sti percorsci inibiscian a fonçion antitumorale de çellole T. L’é stæto demostrou che o blòcco do coenzima tetraidròbiopteriña (BH4) o peu dannezzâ a proliferaçion de çellole T e l’aumento de BH4 into còrpo o peu megioâ a respòsta immunitäia antitumorale mediâ da CD4 e CD8. Pe de ciù, l’effetto immunosopprescivo da chinureniña o peu vegnî rescatou da l’amministraçion de BH4 (5). Into glioblastöma mutante da desidrògenaxi isoçitrata (IDH), a secreçion de l’idròsciglutarato enantiometabòlico (R)-2-idròsciglutarato (R-2-HG) a l’inibisce l’attivaçion, a proliferaçion e l’attivitæ de citolixi de çellole T (6). Ciù de reçente l’é stæto demostrou che o metilgliossale, un sottoproduto da glicoxi, o l’é produto da de çellole soppressore d’origine mielòide e o trasferimento de çellole T do metilgliossale o peu inibî a fonçion de çellole T effettoe. Into trattamento, a neutralizzaçion do metilgliossale a peu scompassâ l’attivitæ de çellole soppressore derivæ da-i mielòidi (MDSC) e megioâ de forma sinergica a terapia de blocco checkpoint inti modelli de ratto (7). Sti studdi enfatizzan inte l’insemme o ròllo ciave di metaboliti derivæ da-o TME inta regolaçion da fonçion e de l’attivitæ de çellole T.
A disfonçion de çellole T a l’é stæta largamente reportâ into cancro a-e ovaie (8). Sto fæto o l’é dovuo in parte a-e caratteristiche metabòliche inerente à l’ipòscia e a-a vascolatua anormale do tumore (9), che se traduxan inta converscion de glucòsio e triptöfano inte di sottoproduti comme l’açido lattico e a cinureniña. O lattato extraçellolare in sovercio o redue a produçion d’interferon-γ (IFN-γ) e o l’impulsa a differençiaçion di sottogruppi mielosopprescivi (10, 11). O consummo de triptöfan o l’inibisce direttamente a proliferaçion de çellole T e o l’inibisce a segnalaçion do reçettô de çellole T (12-14). Sciben che ste osservaçioin, l’é stæto fæto ben ben do travaggio in sciô metabolismo immunitäio in vitro pe mezo de media ottimizæ ò limitou à di modelli de ratto omòloghi in vivo, nisciun di doî o reflette do tutto l’eterogeneitæ di cancro de l’òmmo e l’ambiente macro e micro fisiològico.
Unna caratteristica commun do cancro a-e ovaie a l’é a diffuxon peritoneale e a comparsa d’ascite. L’accumulo de fluido çellolare inte l’ascite o l’é assoçiou à unna mouttia avansâ e à un scarso pronòscio (15). Segondo i rappòrti, sto compartimento unico o l’é ipòscico, o l’à di erti livelli de fattô de crescita endoteliale vascolare (VEGF) e indoleamina 2,3-dioscigenaxi (IDO) e o l’é infiltrou da de çellole T regolatoe e de çellole inibitoe mielòide (15-18). L’ambiente metabòlico de l’ascite o peu ëse despægio da quello do mæximo tumore, donca a reprogrammaçion de çellole T into spaçio peritoneale a no l’é ciæa. Pe de ciù, e differense ciave e l’eterogeneitæ tra l’ascite e i metaboliti presenti inte l’ambiente do tumore peuan frenâ l’infiltraçion de çellole immunitäie e a seu fonçion in scî tumoî e l’é neçessäio de atre reçerche.
Pe resòlve sti problemi, emmo progettou un metodo de spettrometria de massa tandem de seperaçion de çellole senscibile e cromotografia liquida (LC-MS/MS) pe studiâ diversci tipi de çellole (compreiso e çellole T CD4+ e CD8+) e drento e tra i tumoî. Sto metodo o deuviemmo insemme a-a citometria à flusso à erta dimenscion e a-o sequensiamento de l’RNA à çellola sencia (scRNA-seq) pe fornî un retræto assæ resòlto do stato metabòlico de ste popolaçioin ciave. Sto metodo o l’à revelou un aumento scignificativo do livello de 1-metilnicotinamida (MNA) inte çellole T do tumore e di esperimenti in vitro an demostrou che l’effetto immunomodulatô de MNA in sciâ fonçion de çellole T o no l’ea conosciuo primma. Pe commun, sto metodo o revela e interaçioin metabòliche reçiproche tra tumoî e çellole immunitäie e o fornisce de intuiçioin uniche in scî metaboliti da regolaçion immunitäia, che peuan ëse utili pe-o trattamento de l’immunoterapia do cancro de l’ovaio basâ in scê çellole T.
Noemme emmo deuviou a citometria à flusso à erta dimenscion pe quantificâ a-o mæximo tempo l’asciorbimento de glucòsio e l’attivitæ mitocondriale marcatoî tipichi che distinguan e çellole immunitäie e e popolaçioin de çellole tumorale (tabella S2 e figua S1A). St’analixi a l’à demostrou che in confronto a-e çellole T, l’ascite e e çellole tumorale an di livello d’asciorbimento de glucòsio ciù erti, ma an de differense ciù picciñe inte l’attivitæ mitocondriale. L’asciorbimento medio de glucòsio de çellole tumorale [CD45-EpCAM (EpCAM)+] o l’é de træ à quattro vòtte quello de çellole T e l’asciorbimento medio de glucòsio de çellole T CD4+ o l’é 1,2 vòtte quello de çellole T CD8+, cösa ch’a l’indica che i linfoçiti che infiltran o tumore into tumore an di requixiti metabòlichi despægi). Pe contra, l’attivitæ mitocondriale inte çellole tumorale a s’assumeggia à quella de çellole T CD4+ e l’attivitæ mitocondriale de tutti doî i tipi de çellole a l’é ciù erta che quella de çellole T CD8+ (figua 1B). Pe commun, sti resultati mostran o livello metabòlico. L’attivitæ metabòlica de çellole tumorale a l’é ciù erta che quella de çellole T CD4+ e l’attivitæ metabòlica de çellole T CD4+ a l’é ciù erta che quella de çellole T CD8+. Sciben che gh’é sti effetti tra i tipi de çellole, no gh’é de differense coerente into stato metabòlico de çellole T CD4+ e CD8+ ò inte seu proporçioin relative inte l’ascite in confronto a-i tumoî (figua 1C). Pe contra, inta fraçion de çellole CD45, a proporçion de çellole EpCAM+ into tumore a l’é aumentâ in confronto à l’ascite (figua 1D). Noemme emmo osservou ascì unna ciæa differensa metabòlica tra i componenti de çellole EpCAM+ e EpCAM. E çellole EpCAM+ (tumorale) an unn’asciorbimento de glucòsio e unn’attivitæ mitocondriale ciù erte che e çellole EpCAM, ch’a l’é ben ben ciù erta che l’attivitæ metabòlica di fibroblasti inte çellole tumorale inte TME (figua 1, E e F).
(A e B) Intenscitæ mediaña de fluorescensa (MFI) de l’asciorbimento de glucòsio (2-NBDG) (A) e attivitæ mitocondriale de çellole T CD4+ (MitoTracker rosso scuo) (B) Grafichi representativi (à manciña) e dæti tabulæ (à drita), çellole T CD8+ e çellole tumorale EpCAM + CD45-. (C) O rappòrto tra e çellole CD4+ e CD8+ (de çellole T CD3+) inte l’ascite e into tumore. (D) Proporçion de çellole tumorale EpCAM + inte l’ascite e into tumore (CD45-). (E e F) Asciorbimento de glucòsio da matrixe do tumore CD45 e EpCAM-CD45 (2-NBDG) (E) e attivitæ mitocondriale (rosso scuo MitoTracker) (F) grafichi representativi (à manciña) e dæti tabulæ (à drita) Ascite e çellole do tumore. (G) Grafichi representativi de l’esprescion de CD25, CD137 e PD1 pe citometria à flusso. (H e I) Esprescion de CD25, CD137 e PD1 in scê çellole T CD4+ (H) e T CD8+ (I). (J e K) Fenotipi ingenui, de memöia çentrale (Tcm), effettô (Teff) e de memöia effettô (Tem) basæ in sce l’esprescion de CCR7 e CD45RO. E figue representative (à manciña) e i dæti de tabella (a drita) de çellole T CD4+ (J) e çellole T CD8+ (K) inte l’ascite e inti tumoî. I valoî de P determinæ da-o test t in cobbia (*P<0,05, **P<0,01 e ***P<0,001). A linia a rappresenta di paçienti abbinai (n = 6). FMO, fluorescensa meno un; MFI, intenscitæ media de fluorescensa.
Ancon de atre analixi an revelou de atre differense scignificative tra o stato fenotipico de çellole T con unn’erta resoluçion. A memöia attivâ (figua 1, da G à I) e quella effettô (figua 1, J e K) inti tumoî en ben ben ciù frequente che l’ascite (proporçion de çellole T CD3+). Do mæximo, l’analixi do fenotipo pe mezo de l’esprescion di marcatoî d’attivaçion (CD25 e CD137) e di marcatoî d’impoverimento [proteiña da mòrte de çellole programmâ 1 (PD1)] a l’à mostrou che sciben che e caratteristiche metabòliche de ste popolaçioin en despæge (figua S1, B à E) , Ma nisciuña differensa metabòliche scignificativa a l’é stæta osservâ de mainea coerente tra i effetti metabòlichi F à I). Sti exiti en stæti confermæ pe mezo de metodi d’imprendimento automatico pe assegnâ automaticamente di fenotipi de çellole (21), cösa ch’a l’à revelou pe de ciù a presensa de unna gran quantitæ de çellole do midòllo òsseo (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) inte l’ascite do paçiente (figua S2A). Tra tutti i tipi de çellole identificæ, sta popolaçion de çellole mielòide a l’à mostrou l’asciorbimento de glucòsio e l’attivitæ mitocondriale ciù erte (figua S2, da-o B a-o G). Sti resultati mettan in luxe e fòrte differense metabòliche tra i diversci tipi de çellole che s’attreuvan inte l’ascite e inti tumoî inti paçienti con HGSC.
A sfidda prinçipâ pe comprende e caratteristiche metabòniche da TIL a l’é a neçescitæ d’isolâ di campioin de çellole T de purezza, qualitæ e quantitæ assæ da-i tumoî. Di studdi reçenti an demostrou che i metodi de classificaçion e d’inricchimento de perle basæ in sciâ citometria à flusso peuan portâ à di cangi inti profili di metaboliti de çellole (22-24). Pe scompassâ sto problema, emmo ottimizzou o metodo d’inricchimento de perle pe isolâ e isolâ TIL da-o cancro de l’ovaio uman reçetto chirurgicamente primma de l’analixi pe LC-MS/MS (s’ammie Materiali e metodi; figua 2A). Pe valuâ l’impatto complescivo de sto protocòllo in scî cangi di metaboliti, emmo confrontou i profî di metaboliti de çellole T attivæ da di donatoî sani dòppo o passo de separaçion de perle mensunou de d’ato con de çellole che no ean separæ da-e perle ma ch’arrestavan in sciâ giassa. St’analixi do contròllo da qualitæ a l’à nottou che gh’é unn’erta correlaçion tra ste doe condiçioin (r = 0,77) e a repetibilitæ tecnica do gruppo de 86 metaboliti a l’à unn’erta repetibilitæ (figua 2B). De conseguensa, sti metodi peuan fâ unn’analixi preçisa di metaboliti inte çellole sottopòste à un inricchimento de tipo çellolare, fornindo coscì a primma ciattaforma à erta resoluçion pe identificâ di metaboliti speçifichi inte HGSC, permettendo coscì a-e persoñe d’ottegnî unna comprenscion ciù profonda da speçificitæ de çellole Programma de metabolismo sessuale.
(A) Diagramma schematico de l’inricchimento de perle magnetiche. Avanti de l’analixi pe LC-MS/MS, e çellole patian trei çicli consecutivi d’inricchimento con de perle magnetiche ò arrestan in sciâ giassa. (B) L’effetto do tipo d’inricchimento in sce l’abbondansa de metaboliti. A media de træ mesue pe ògni tipo d’inricchimento ± SE. A linia grixa a rappresenta unna relaçion 1:1. A correlaçion intra-classe (ICC) de mesue repetue a l'é mostrâ inte l'etichetta de l'asse. NAD, dinucleotide d’adeniña nicotinamida. (C) Diagramma schematico do flusso de travaggio de l’analixi di metaboliti do paçiente. L’ascite ò i tumoî vëgnan recuggeiti da-i paçienti e crioconservæ. Unna porçion picciña de ògni campion a l'é stæta analizzâ pe citometria à flusso, incangio i atri campioin an subio trei çicli d'inricchimento pe-e çellole CD4+, CD8+ e CD45. Ste fraçioin de çellole en stæte analizzæ pe mezo de LC-MS/MS. (D) Mappa de calô de l’abbondansa de metabòliti standardizzæ. O dendrogramma o rappresenta l'aggruppamento de distanse euclidee tra-i campioin do Ward. (E) Analixi di componenti prinçipæ (PCA) da mappa do metabolito do campion, ch'a mostra træ replicæ de ògni campion, i campioin do mæximo paçiente son ligæ da unna linia. (F) O PCA do profî de metabolito do campion condiçionou in sciô paçiente (saieiva à dî con deuviâ a redondansa parçiale); o tipo de campion o l'é limitou da-o scafo convesso. PC1, componente prinçipâ 1; PC2, componente prinçipâ 2.
Pe avanti, emmo applicou sto metodo d’inricchimento pe analizzâ 99 metaboliti inte fraçioin de çellole CD4+, CD8+ e CD45 inte l’ascite e inti tumoî primmäi de sëi paçienti con HGSC (figua 2C, figua S3A e tabella S3 e S4). A popolaçion d'interesse a rappresenta da-o 2% a-o 70% do gran campion originale de çellole vivente e a proporçion de çellole a cangia ben ben tra-i paçienti. Dòppo avei separou e perle, a fraçion inricchia d'interesse (CD4+, CD8+ ò CD45-) a rappresenta in media ciù de l'85% de tutte e çellole vivente into campion. Sto metodo d'inricchimento o ne permette d'analizzâ de popolaçioin de çellole da-o metabolismo di tesciui tumorali de l'òmmo, cösa ch'a l'é imposcibile fâ da di gren campioin. Pe mezo de sto protocòllo emmo stabilio che a l-chinureniña e l’adenosiña, sti doî metaboliti immunosopprescivi ben caratterizzæ, ean elevæ inte çellole T do tumore ò inte çellole do tumore (figua S3, B e C). De conseguensa, sti resultati demostran a fedeltæ e a capaçitæ da nòstra tecnologia de seperaçion de çellole e de spettrometria de massa d’attrovâ di metaboliti biologicamente importanti inti tesciui di paçienti.
A nòstra analixi a l’à revelou ascì unna fòrte separaçion metabòlica di tipi de çellole drento e tra i paçienti (figua 2D e figua S4A). Ciù into dettaggio, in confronto à di atri paçienti, o paçiente 70 o l’à mostrou de caratteristiche metabòliche despæge (figua 2E e figua S4B), cösa ch’a l’indica che peu ësighe unn’eterogeneitæ metabòlica sostançiale tra i paçienti. Va dito che in confronto à di atri paçienti (da 1,2 à 2 litri; Tabella S1), a quantitæ totale d'ascite arrecuggeita into paçiente 70 (80 ml) a l'ea ciù picciña. O contròllo de l’eterogeneitæ interpaçiente durante l’analixi di componenti prinçipæ (comme pe mezo de l’analixi de redondansa parçiale) o mostra di cangi coerenti tra i tipi de çellole e i tipi de çellole e/ò o microambiente vëgnan aggregæ ciæamente in sciâ base do profî do metabolito (figua 2F). L’analixi di metaboliti senci a l’à enfatizzou sti effetti e a l’à revelou de differense scignificative tra i tipi de çellole e o microambiente. Va dito che a differensa ciù estrema osservâ a l’é o MNA, che pe-o sòlito o l’é inricchio inte çellole CD45 e inte çellole CD4+ e CD8+ che s’infiltran into tumore (figua 3A). Pe-e çellole CD4+ st’effetto o l’é ciù òvvio e o MNA inte çellole CD8+ o pâ ascì ëse fortemente influensou da l’ambiente. À tutti i mòddi, sto fæto o no l’é importante, perché solo trei di sëi paçienti peuan vegnî valuæ pe-i pontezzi CD8+ do tumore. In azzonta à l’MNA, inte diverse qualitæ de çellole inte l’ascite e inti tumoî, di atri metaboliti caratterizzæ pöco da TIL en ascì ricchi de forma differensiale (figue S3 e S4). De conseguensa, sti dæti revelan un insemme promettendo de metaboliti immunomodulatoî pe de atre reçerche.
(A) Contegnuo normalizzou de MNA inte çellole CD4+, CD8+ e CD45- da l’ascite e do tumore. O grafico da scatoa o mostra a mediaña (linia), l'intervallo interquartile (çernia do quaddro) e l'intervallo di dæti, fin à 1,5 vòtte l'intervallo interquartile (barba do quaddro). Comme descrito inti Materiali e metodi pe paçienti, deuviâ o valô de limma do paçiente pe determinâ o valô de P (*P<0,05 e **P<0,01). (B) Diagramma schematico do metabolismo do MNA (60). Metabòliti: S-adenoxilo-1-metioniña; SAH, S-adenosiña-1-omoçisteiña; NA, nicotinamida; MNA, 1-metilnicotinamida; 2-PY, 1-metil- 2-piridòna-5-carbossamido; 4-PY, 1-metil-4-piridòna-5-carbossamida; NR, ribòsa de nicotinamida; NMN, mononucleotide de nicotinamida. Enzimi (verde): NNMT, N-metiltrasferaxi da nicotinamida; SIRT, scirtuin; NAMPT, trasferaxi fosforiboxilo de nicotinamide; AOX1, aldeide oscidaxi 1; NRK, chinaxi ribòscida de nicotinamide; NMNAT, trasferaxi de l’adenilato mononucleotidico de nicotinamida; Pnp1, fosforilaxi do nucleòscido de puriña. (C) t-SNE de scRNA-seq de l’ascite (grixo) e do tumore (rosso; n = 3 paçienti). (D) Esprescion de NNMT inte diverse popolaçioin de çellole identificæ pe mezo de scRNA-seq. (E) Esprescion de NNMT e AOX1 inte SK-OV-3, into reen embrionale de l’òmmo (HEK) 293T, inte çellole T e inte çellole T trattæ con MNA. L’esprescion arrepiegâ a se mostra in relaçion à SK-OV-3. Se mostra o modello d’esprescion co-o SEM (n = 6 doatoî sani). I valoî de Ct ciù grendi de 35 son tegnui pe no relevâ (UD). (F) Esprescion de SLC22A1 e SLC22A2 inte çellole T SK-OV-3, HEK293T e çellole T trattæ con MNA 8 mM. L’esprescion arrepiegâ a se mostra in relaçion à SK-OV-3. Se mostra o modello d’esprescion co-o SEM (n = 6 doatoî sani). I valoî de Ct ciù grendi de 35 son tegnui pe no relevâ (UD). (G) Contegnuo de MNA de çellole inte çellole T donatô sane attivæ dòppo 72 oe d’incubaçion con MNA. Se mostra o modello d’esprescion co-o SEM (n = 4 doatoî sani).
O MNA o ven produto co-o trasferimento do gruppo metilico da S-adenosil-1-metioniña (SAM) a-a nicotinamida (NA) pe mezo da nicotinamida N-metiltrasferaxi (NNMT; figua 3B). NNMT o l’é sorveespresso inte unna gran quantitæ de cancro de l’òmmo e o l’é assoçiou a-a proliferaçion, à l’invaxon e a-e metastaxi (25-27). Pe capî megio a vivagna de MNA inte çellole T in TME, emmo deuviou scRNA-seq pe caratterizzâ l’esprescion de NNMT inte tutti i tipi de çellole inte l’ascite e inti tumoî de trei paçienti con HGSC (tabella S5). L’analixi de 6.500 çellole pöcassæ a l’à demostrou che inte di ambienti d’ascite e de tumore, l’esprescion de NNMT a l’ea restreita a-e popolaçioin de fibroblasti e de çellole tumorale che se pensava (figua 3, C e D). Va dito che no gh’é unn’esprescion òvvia de NNMT inte nisciuña popolaçion ch’a l’esprimme PTPRC (CD45 +) (figua 3D e figua S5A), cösa ch’a l’indica che o MNA relevou into spettro di metaboliti o l’é stæto introduto inte çellole T. L’esprescion de l’aldeide oscidaxi 1 (AOX1) a converte o MNA inte 1-metil-2-piridoña-5-carbossamida (2-PYR) ò 1-metil-4-piridoña-5-carbossamida (4-PYR); A figua 3B) a l’é restreita ascì a-a popolaçion de fibroblasti ch’esprimman COL1A1 (figua S5A), che insemme indican che e çellole T n’an a capaçitæ de metabolismo MNA convençionale. O modello d’esprescion de sti geni ligæ à MNA o l’é stæto verificou pe mezo de un segondo insemme de dæti de çellole independente da l’ascite de paçienti con HGSC (figua S5B; n = 6) (16). Pe de ciù, l’analixi quantitativa da reaçion à cadeña da polimeraxi (qPCR) de çellole T donatoe sane trattæ con MNA a l’à demostrou che in confronto a-e çellole tumorale de l’ovaio SK-OV-3 de contròllo, NNMT ò AOX1 no ean squæxi espresse (figua 3E). Sti resultati inatteisi indican che o MNA o peu vegnî secreto da-i fibroblasti ò da-i tumoî inte çellole T vexiñe inta TME.
Sciben che i candidæ comprendan a famiggia di traspòrtoî de catioin organichi da-o 1 a-o 3 (OCT1, OCT2 e OCT3) codificæ da-a famiggia do portatô solubile 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 e SLC22A3), i traspòrtoî potensiali de MNA en ancon indefinii (28). O QPCR de mRNA de çellole T donatoe sane o l’à mostrou di livello d’esprescion basci de SLC22A1 ma di livello no relevâ de SLC22A2, cösa ch’a l’à confermou ch’o l’ea stæto reportou in preçedensa inta lettiatua (figua 3F) (29). Pe contra, a linia de çellole do tumore ovaio SK-OV-3 a l’esprimmeiva di livelli erti de tutti doî i traspòrtoî (figua 3F).
Pe verificâ a poscibilitæ che e çellole T aggian a capaçitæ de sciorbî MNA estraneo, e çellole T donatoe sane en stæte cortivæ pe 72 oe in presensa de diverse conçentraçioin de MNA. In assensa de MNA esogeno, o contegnuo çellolare de MNA o no peu vegnî relevou (figua 3G). À tutti i mòddi, e çellole T attivæ trattæ con MNA esogeno an mostrou un aumento dependente da dòse do contegnuo de MNA inte çellole, fin à 6 mM de MNA (figua 3G). Sto resultato o l’indica che ascì co-o basso livello d’esprescion do traspòrtô e a mancansa de l’enzima prinçipâ responsabile do metabolismo intraçellolare do MNA, TIL o peu ancon piggiâ o MNA.
O spettro di metaboliti inte çellole T di paçienti e inti esperimenti d’assorbimento de MNA in vitro accrescian a poscibilitæ che i fibroblasti assoçiæ a-o cancro (CAF) secretan MNA e e çellole tumorale pòssan regolâ o fenotipo e a fonçion da TIL. Pe determinâ l’effetto do MNA in scê çellole T, e çellole T donatoe sane en stæte attivæ in vitro in presensa ò in assensa de MNA e a seu proliferaçion e a seu produçion de citochine en stæte valuæ. Dòppo 7 giorni d’azzonta de MNA a-a dòse ciù erta, o numero de raddoppio da popolaçion o l’é stæto moderatamente reduto, tanto che o vigoî o s’é mantegnuo à tutte e dòse (figua 4A). Pe de ciù, o trattamento de MNA esogeno o l’à portou à un aumento da proporçion de çellole T CD4+ e CD8+ ch’esprimman o fattô de necròxi tumorale-α (TNFα; figua 4B). Pe contra, a produçion intraçellolare d’IFN-γ a l’é stæta scignificativamente reduta inte çellole T CD4+, ma no inte çellole T CD8+ e no gh’é stæto nisciun cangio scignificativo inte l’interleuchina 2 (IL-2; figua 4, C e D). De conseguensa, l’assay immunosorbente ligou à l’enzima (ELISA) di sorvenatanti de ste coltue de çellole T trattæ con MNA o l’à mostrou un aumento scignificativo de TNFα, unna diminuçion de IFN-γ e nisciun cangio de IL-2 (figua 4, E à G). . A diminuçion de IFN-γ a l’indica che o MNA o peu zugâ un ròllo inte l’inibiçion de l’attivitæ antitumorale de çellole T. Pe scimolâ l’effetto do MNA in sciâ citotosciçitæ mediâ da-e çellole T, e çellole do reçettô T de l’antigene chimerico (FRα-CAR-T) che miran a-o reçettô de folato α e a-o CAR-T (GFP) regolæ da-e çellole da proteiña fluorescente verde (GFP) -CAR-T) vëgnan produte da-e çellole de sangue periferico de donatô sani (monònucleo PBMC de çellole donatô). E çellole CAR-T en stæte cortivæ pe 24 oe in presensa de MNA e dapeu en stæte co-cortivæ con de çellole tumorale de l’ovaio SK-OV-3 de l’òmmo ch’esprimman o reçettô de folato α inte un rappòrto effettô/bersalio de 10:1. O trattamento con MNA o l’à portou à unna diminuçion scignificativa de l’attivitæ d’ammassâ de çellole FRα-CAR-T, ch’a s’assumeggia à quelle FRα-CAR-T trattæ con adenosiña (figua 4H).
(A) Conto totale de çellole vitæ e raddoppio da popolaçion (PD) direttamente da-a coltua a-o giorno 7. O grafico à bare o representa a media + SEM de sëi doatoî sani. Rappresenta di dæti a-o manco de n = 3 esperimenti independenti. (B à D) CD3/CD28 e IL-2 en stæti deuviæ pe attivâ e çellole T a-e respettive conçentraçioin de MNA pe 7 giorni. Avanti de l’analixi, e çellole en stæte stimolæ con PMA/ionomiçiña con GolgiStop pe 4 oe. Esprescion de TNFα (B) inte çellole T. Exempio d’imagine (à manciña) e dæti de tabella (à drita) de l’esprescion de TNFα inte çellole vivente. Esprescion d’IFN-γ (C) e IL-2 (D) inte çellole T. L’esprescion de citociñe a l’é stæta mesuâ pe mezo da citometria à flusso. O grafico à bare o rappresenta a media (n = 6 doatoî sani) + SEM. Addeuviâ l'analixi à senso unico da variansa e de mesue repetue (*P<0,05 e **P<0,01) pe determinâ o valô de P. Rappresenta di dæti a-o manco de n = 3 esperimenti independenti. (E à G) CD3/CD28 e IL-2 en stæti deuviæ pe attivâ e çellole T a-e respettive conçentraçioin de MNA pe 7 giorni. O mezzo o l’é stæto recuggeito avanti e dòppo 4 oe de stimolaçion PMA/ionomiçiña. E conçentraçioin de TNFα (E), IFN-γ (F) e IL-2 (G) en stæte mesuæ pe ELISA. O grafico à bare o rappresenta a media (n = 5 doatoî sani) + SEM. O valô de P determinou pe mezo de l'analixi à senso unico da variansa e de mesue repetue (*P<0,05). A linia pontettâ a l’indica o limite de relevaçion da relevaçion. (H) Analixi de lixi de çellole. E çellole FRα-CAR-T ò GFP-CAR-T en stæte regolæ con adenosiña (250 μM) ò MNA (10 mM) pe 24 oe ò lasciæ sensa trattamento (Ctrl). L’é stæto mesuou a perçentuale d’ammassâ de çellole SK-OV-3. Valô de P determinou da-o test t de Welch (*P<0,5 e **P<0,01).
Pe ottegnî unna comprenscion mecanistica da regolaçion de l’esprescion de TNFα dependente da-o MNA, l’é stæto valuou i cangi into mRNA de TNFα de çellole T trattæ con MNA (figua 5A). E çellole T donatoe sane trattæ con MNA an mostrou un aumento doggio di livello de trasmiscion de TNFα, cösa ch’a l’indica che o MNA o depende da-a regolaçion da trasmiscion de TNFα. Pe indagâ sto poscibile mecanismo de regolaçion, l’é stæto valuou doî fattoî de trasmiscion conosciui che regolan TNFα, saieiva à dî o fattô nucleare de çellole T attivæ (NFAT) e a proteiña speçifica 1 (Sp1), comme respòsta a-o ligamme de MNA a-o promotô TNFα proscimale ( 30 ). O promotô TNFα o contëgne 6 sciti de ligamme NFAT identificæ e 2 sciti de ligamme Sp1, che se creuvan in sce un scito [-55 cobbie de base (bp) da-o 5’cap] (30). L’immunopreçipitaçion da cromatiña (ChIP) a l’à demostrou che quande o l’é stæto trattou con MNA, o ligamme de Sp1 a-o promotô TNFα o l’é aumentou de træ vòtte. L'incorporaçion do NFAT a l'é cresciua ascì e a s'é avvexinâ à l'importansa (figua 5B). Sti dæti indican che o MNA o regola l’esprescion de TNFα pe mezo da trasmiscion Sp1 e inte unna mesua ciù picciña l’esprescion de NFAT.
(A) In confronto a-e çellole T cortivæ sensa MNA, o cangio de piega de l’esprescion de TNFα inte çellole T trattæ con MNA. Se mostra o modello d’esprescion co-o SEM (n = 5 doatoî sani). Rappresenta di dæti a-o manco de n = 3 esperimenti independenti. (B) O promotô TNFα de çellole T trattæ con ò sensa MNA 8 mM dòppo che NFAT e Sp1 en stæti combinæ con (Ctrl) e stimolaçion PMA/ionomiçiña pe 4 oe. L’immunoglobuliña G (IgG) e H3 en stæte deuviæ comme contròlli negativi e poxitivi pe l’immunopreçipitaçion rispettivamente. A quantificaçion de ChIP a l’à demostrou che o ligamme de Sp1 e NFAT a-o promotô TNFα inte çellole trattæ con MNA o l’é aumentou diverse vòtte in confronto a-o contròllo. Rappresenta di dæti a-o manco de n = 3 esperimenti independenti. Valô de P determinou da ciù test t (*** P <0,01). (C) In confronto à l’ascite de HGSC, e çellole T (no citotòsciche) an mostrou unn’esprescion aumentâ de TNF into tumore. I coî rappresentan di paçienti despægi. E çellole mostræ en stæte campionæ à un mòddo casuale à 300 e sciortie pe limitâ o disegno de ciù (** Padj = 0,0076). (D) Modello propòsto de MNA pe-o cancro a-e ovaie. O MNA o ven produto inte çellole do tumore e inti fibroblasti into TME e o ven assonto da-e çellole T. O MNA o l’accresce o ligamme de Sp1 a-o promotô TNFα, e o pòrta à un aumento da trasmiscion de TNFα e da produçion de citochine TNFα. O MNA o pròvoca ascì unna diminuçion de l’IFN-γ. L’inibiçion da fonçion de çellole T a pòrta à unna capaçitæ d’ammassâ reduta e à unna crescita accelerâ do tumore.
Segondo i rappòrti, o TNFα o l’à di effetti antitumorali e antitumorali dependenti da-o fronte e da-o derê, ma o l’à un ròllo ben conosciuo inta promoçion da crescita e de metastaxi do cancro a-e ovaie (31-33). Segondo i rappòrti, a conçentraçion de TNFα inte l’ascite e inti tesciui tumorali inti paçienti con cancro a-e ovaie a l’é ciù erta che quella inti tesciui benigni (34-36). In termini de mecanismo, o TNFα o peu regolâ l’attivaçion, a fonçion e a proliferaçion de çellole gianche do sangue e cangiâ o fenotipo de çellole cançerose (37, 38). In coerensa con ste descoverte, l’analixi de l’esprescion genica differensiale a l’à demostrou che o TNF o l’ea scignificativamente regolou in çimma inte çellole T inti tesciui tumorali in confronto à l’ascite (figua 5C). L’aumento de l’esprescion de TNF o l’ea evidente solo inte popolaçioin de çellole T con un fenotipo no citotòscico (figua S5A). Pe compilâ, sti dæti sostëgnan l’opinion che o MNA o l’agge di doggi effetti immunosopprescivi e de promoçion do tumore inte HGSC.
L’etichettatua fluorescente basâ in sciâ citometria à flusso a l’é vegnua o metodo prinçipâ pe studiâ o metabolismo TIL. Sti studdi an demostrou che in confronto a-i linfoçiti do sangue periferico ò a-e çellole T d’òrgani linfòidi segondäi, a TIL muriña e umaña a l’à unna tendensa ciù erta à asciorbî do glucòsio (4, 39) e a perdia gradduale da fonçion mitocondriale (19, 40). Sciben che emmo osservou di resultati pægi inte sto studio, o sviluppo ciave o l’é de confrontâ o metabolismo de çellole tumorale e TIL da-o mæximo tesciuo tumorale reçetto. In coerensa con çertidun de sti rappòrti preçedenti, e çellole do tumore (CD45-EpCAM +) de l’ascite e di tumoî an unn’asciorbimento de glucòsio ciù erto che e çellole T CD8 + e CD4 +, cösa ch’a sostëgne che l’erta asciorbimento de glucòsio de çellole do tumore a peu vegnî confrontâ co-e çellole T. O conçetto de competiçion de çellole T. TME. À tutti i mòddi, l’attivitæ mitocondriale de çellole tumorale a l’é ciù erta che quella de çellole T CD8+, ma l’attivitæ mitocondriale a s’assumeggia à quella de çellole T CD4+. Sti exiti rinfòrsan o tema emerzente che o metabolismo oscidativo o l’é importante pe-e çellole do tumore (41, 42). Suggeriscian ascì che e çellole T CD8+ peuan ëse ciù suscettile a-a disfonçion oscidativa che e çellole T CD4+ ò che e çellole T CD4+ peuan deuviâ de vivagne de carbònio despæge da-o glucòsio pe mantegnî l’attivitæ mitocondriale (43, 44). Va dito che no emmo osservou de differense inte l’asciorbimento de glucòsio ò inte l’attivitæ mitocondriale tra i effettoî T CD4+, a memöia di effettoî T e e çellole da memöia çentrale T inte l’ascite. Do mæximo, o stato de differençiaçion de çellole T CD8+ inti tumoî o no l’à da fâ co-i cangi inte l’asciorbimento de glucòsio, cösa ch’a l’evidençia a differensa scignificativa tra e çellole T cortivæ in vitro e a TIL de l’òmmo in vivo (22). Ste osservaçioin en stæte confermæ ascì da l’utilizzaçion de l’allocaçion automatica imparçiale da popolaçion de çellole, ch’a l’à revelou pe de ciù che e çellole CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + con unn’asciorbimento de glucòsio e unn’attivitæ mitocondriale ciù erta che e çellole tumorale en prevalente ma an unna popolaçion de çellole attive metabòliche. Sta popolaçion a peu rappresentâ a sottopopolaçion putativa de çellole soppressoe mielòide ò de çellole dendritiche plasmaçitòide identificæ inte l’analixi scRNA-seq. Sciben che tutti doî sti chì en stæti reportæ inti tumoî de l’ovaio de l’òmmo [45], an ancon de beseugno de un travaggio in ciù pe descrive sta sottopopolaçion mielòide.
Sciben che i metodi basæ in sciâ citometria de flusso peuan ascciæî e differense generale into glucòsio e into metabolismo oscidativo tra i tipi de çellole, i metaboliti preçixi produti da-o glucòsio ò da atre vivagne de carbònio pe-o metabolismo mitocondriale inta TME no en stæti ancon determinæ. Pe assegnâ a presensa ò l’assensa de metaboliti à un çerto sottoinsemme TIL ghe veu a purificaçion da popolaçion de çellole da-o tesciuo esciso. De conseguensa, o nòstro metodo d’inricchimento de çellole combinou co-a spettrometria de massa o peu fornî de intuiçioin in scî metaboliti inricchii de mainea differençiâ inte çellole T e inte popolaçioin de çellole tumorale inte di campioin de paçienti correspondenti. Sciben che sto metodo o l’à di avvantaggi in sciâ classificaçion de çellole attivâ da-a fluorescensa, çerte biblioteche de metaboliti peuan vegnî influensæ apreuvo a-a stabilitæ intrinseca e/ò a-o tasso de rotaçion spedio (22). Con tutto, o nòstro metodo o l'é stæto bon d'identificâ doî metaboliti immunosopprescivi reconosciui, l'adenosiña e a chinureniña, perché cangian ben ben tra-i tipi de campioin.
A nòstra analixi metabònòmica di tumoî e di sottotipi de TIL a fornisce ciù informaçioin in sciô ròllo di metaboliti inta TME de l’ovaio. Pe primma cösa, pe mezo da citometria à flusso, emmo stabilio che no gh’ea de differense inte l’attivitæ mitocondriale tra i tumoî e e çellole T CD4+. À tutti i mòddi, l’analixi LC-MS/MS a l’à revelou di cangi scignificativi inte l’abbondansa de metaboliti tra ste popolaçioin, cösa ch’a l’indica che e concluxoin in sciô metabolismo de TIL e in sciâ seu attivitæ metabòlica complesciva domandan unn’interpretaçion attenta. In segondo leugo, o MNA o l’é o metabolito co-a differensa ciù grande tra e çellole CD45 e e çellole T inte l’ascite, no inti tumoî. De conseguensa, a compartimentaçion e a poxiçion do tumore peuan avei di effetti despægi in sciô metabolismo TIL, cösa ch’a l’evidençia a poscibile eterogeneitæ inte un çerto microambiente. In terso leugo, l’esprescion de l’enzima produttô de MNA NNMT a l’é limitâ pe-o ciù à CAF, ch’a l’é de çellole tumorale inte unna mesua ciù picciña, ma s’osserva di livello de MNA che se peuan nottâ inte çellole T derivæ da-o tumore. A sovraesprescion de NNMT inta CAF ovaia a l’à un effetto conosciuo ch’o promeuve o cancro, in parte dovuo a-a promoçion do metabolismo de CAF, de l’invaxon do tumore e de metastaxi (27). Sciben che o livello complescivo de TIL o l’é moderou, l’esprescion de NNMT inta CAF a l’é ligâ streitamente a-o sottotipo mesenchimico de l’Atlante do genöma do cancro (TCGA), ch’o l’é assoçiou à un scarso pronòscio (27, 46, 47). Pe finî, l’esprescion de l’enzima AOX1 responsabile da degraddaçion do MNA a l’é limitâ ascì a-a popolaçion CAF, cösa ch’a l’indica che e çellole T n’an a capaçitæ de metabolizzâ o MNA. Sti resultati sostëgnan l’idea che sciben che l’é neçessäio di atri travaggi pe verificâ sta descoverta, di erti livello de MNA inte çellole T peuan indicâ a presensa de un microambiente CAF immunosopprescivo.
Dæto o basso livello d’esprescion di traspòrtoî de MNA e i livello no relevæ de proteiñe ciave ligæ a-o metabolismo de MNA, a presensa de MNA inte çellole T a l’é inaspëtâ. Ni NNMT ni AOX1 an posciuo ëse individuæ pe mezo de l'analixi scRNA-seq e da qPCR mirâ à doe coorte independente. Sti resultati indican che o MNA o no ven scintetizzou da-e çellole T, ma sciorbio da-o TME ch’o l’à d’in gio. Di esperimenti in vitro demostran che e çellole T tendan à ammuggiâ MNA esogeno.
I nòstri studdi in vitro an demostrou che o MNA esogeno o l’induxe l’esprescion de TNFα inte çellole T e o megioa o ligamme de Sp1 a-o promotô de TNFα. Sciben che o TNFα o l’à de fonçioin tanto antitumorale comme antitumorale, into cancro a-i ovai, o TNFα o peu promeuve a crescita do cancro a-i ovai (31-33). A neutralizzaçion de TNFα inta coltua de çellole tumorale de l’ovaio ò l’eliminaçion do segnâ TNFα inti modelli de ratto peuan megioâ a produçion de citochine inflammatoie mediæ da TNFα e inibî a crescita do tumore (32, 35). De conseguensa, inte sto caxo, o MNA deriviou da-o TME o peu agî comme metabolito pro-infiammatöio pe mezo de un mecanismo dependente da TNFα pe mezo do çiclo autocrino, promeuvendo coscì a comparsa e a diffuxon do cancro a-e ovaie (31). In sciâ base de sta poscibilitæ, o blòcco de TNFα o l’é stæto studiou comme agente terapeutico potençiale pe-o cancro a-e ovaie (37, 48, 49). Pe de ciù, o MNA o l’altera a citotosciçitæ de çellole CAR-T verso e çellole tumorale de l’ovaio, e o fornisce de atre preuve pe-a sopprescion immunitäia mediâ da-o MNA. Insemme, sti resultati suggeriscian un modello donde i tumoî e e çellole CAF secretan MNA inte TME extraçellolare. Pe mezo de (i) stimolaçion da crescita do cancro à l’ovaio induta da-o TNF e (ii) l’inibiçion de l’attivitæ citotòscica de çellole T induta da-o MNA, questo o peu avei un effetto tumorale doggio (figua 5D).
Pe finî, con applicâ unna combinaçion d’inricchimento spedio de çellole, sequensiamento de çellole sence e profilaçion metabòlica, sto studio o l’à revelou e enorme differense immunometabòliche tra tumoî e çellole d’ascite inti paçienti con HGSC. St’analixi completa a l’à demostrou che gh’é de differense inte l’asciorbimento de glucòsio e inte l’attivitæ mitocondriale tra e çellole T e a l’à identificou o MNA comme un metabolito regolatô immunitäio autònomo no çellolare. Sti dæti an un effetto in sce comme a TME a l’influisce in sciô metabolismo de çellole T inti cancro de l’òmmo. Sciben che l’é stæto reportou a competiçion diretta pe-i nutrienti tra e çellole T e e çellole cançerose, i metaboliti peuan fonçionâ ascì comme regolatoî indiretti pe promeuve a progrescion do tumore e eventualmente sopprimme e respòste immunitäie endògene. L’atra descriçion do ròllo fonçionale de sti metaboliti de regolaçion a peu arvî de strategie alternative pe megioâ a respòsta immunitäia antitumorale.
I campioin de paçienti e i dæti clinichi en stæti ottegnui pe mezo do depòxito de tesciui do tumore do cancao BC çertificou da-a ræ canadeise de depòxito de tesciui. Segondo o protocòllo approvou da-o Comitato Etico da Reçerca in sciô Cancao do BC e da l'Universcitæ da Columbia Britannica (H07-00463), tutti i campioin e i dæti clinichi di paçienti an ottegnuo un consenso informou à scrito ò an renonçiou formalmente a-o seu consenso. I campioin son conservæ inta Biobanca çertificâ (BRC-00290). E caratteristiche into menuo do paçiente son mostræ inte tabelle S1 e S5. Pe-a crioconservaçion, se deuvia un bisturi pe decompoñe mecanicamente o campion de tumore do paçiente e dapeu sponciâlo atraverso de un filtro de 100 micron pe ottegnî unna sospenscion de çellole sencia. L'ascite do paçiente a l'é stæta centrifuga à 1500 rpm pe 10 menuti à 4°C pe pellettâ e çellole e remeuve o sorvenatante. E çellole ottegnue da-o tumore e da l’ascite en stæte crioconservæ inte un særo AB uman inattivou da-o cado a-o 50% (Sigma-Aldrich), RPMI-1640 a-o 40% e sorfòscido de dimetil a-o 10%. Ste sospenscioin de çellole sence conservæ en stæte deslenguæ e deuviæ pe-a metabolomica e a determinaçion di metaboliti descriti chì sotta.
O mezzo completo o consciste inte 0.22 μm filtræ 50:50 supplementæ con RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2,05 mM de l-glutamina (termofisher scientifico) supplementæ con do særo AB uman inattivou da-o cado a-o 10% (Sigma-Aldrich), 12,5 mM de epe (termofisher scientifico), 2 mM l-glutamina (termofisher scientifico) Soluçion de streptomiçiña (PenStrep) e 50 μMB de mercaptoetanölo. AimV (Invitrogen) o l’é supplementou con 20 mM d’epes (scientifico termofisher) e 2 mM l-glutamina (scientifico termofisher). O tampon de coloraçion do citometro de flusso o conscisteiva inte unna soluçion salina tamponâ con fosfato filtrâ de 0.22 μm (PBS; Invitrogen) supplementâ con do særo uman AB inattivou da-o cado a-o 3% (Sigma). O tampon d’inricchimento de çellole o l’é compòsto da PBS filtrou de 0.22 μm e o l’é supplementou con do særo AB uman inattivou da-o cado a-o 0.5% (Sigma-Aldrich).
Inte un mezzo completo à 37°C, e çellole en stæte coloræ con 10 nM MT DR e 100 μM 2-NBDG pe 30 menuti. Dapeu, e çellole en stæte coloræ co-o tintô de vitalitæ eF506 à 4°C pe 15 menuti. Sospende torna e çellole inte un blocco FC (eBioscience) e into tampon de coloraçion brillante (BD Biosciences), diluîle inte un tampon de coloraçion do citometro à flusso (segondo e istruçioin do produttô) e incubâle pe 10 menuti à temperatua ambiente. Colorâ e çellole con un insemme d’anticòrpi (tabella S2) inte un tampon de coloraçion de citometria à flusso à 4°C pe 20 menuti. Sospende torna e çellole inte un tampon de coloraçion pe citometria à flusso (Cytek Aurora; configuraçion 3L-16V-14B-8R) primma de l’analixi. Deuviâ SpectroFlo e FlowJo V10 pe analizzâ i dæti do numero de çellole e deuviâ GraphPad Prism 8 pe creâ i dæti. L'intensitæ media de fluorescensa (MFI) de 2-NBDG e MT DR a l'é stæta normalizzâ log e dapeu l'é stæto addeuviou un test t in cobbia pe l'analixi statistica pe tegnî conto di paçienti abbinai. Remette da l'analixi tutte e popolaçioin con ciù pöco de 40 eventi; inserî un valô de MFI de 1 pe quæ se segge valoî negativo avanti d'effettuâ unn'analixi statistica e a vixoalizzaçion di dæti.
Pe completâ a strategia de gating manuale do pannello de proçesso mensunou de d’ato, emmo deuviou l’annotaçion completa de l’erbo de restriçion da forma (FAUST) (21) pe assegnâ automaticamente de çellole a-a popolaçion dòppo avei eliminou e çellole mòrte inte FlowJo. Gestemmo à man l’output pe azzonze de popolaçioin che pan ëse allocæ pe errô (combinâ PD1+ con de çellole tumorale PD1) e de popolaçioin trattegnue. Ògni campion o contëgne in media ciù do 2% de çellole, pe un totale de 11 popolaçioin.
A centrifugaçion de denscitæ de gradiente de ficoll a l’é stæta deuviâ pe separâ o PBMC da-i produti de seperaçion di leucoçiti (tecnologie STEMCELL). E çellole T CD8+ en stæte isoæ da PBMC pe mezo de microperle CD8 (Miltenyi) e espanse inte un mezzo completo pe mezo de TransAct (Miltenyi) pe doe settemañe segondo e istruçioin do produttô. E çellole en stæte lasciæ stâ pe 5 giorni inte un mezzo completo ch’o contegniva IL-7 (10 ng/ml; PeproTech) e dapeu en stæte stimolæ torna con TransAct. A-o giorno 7, segondo e istruçioin do produttô, e microperle CD45 umañe (Miltenyi) en stæte deuviæ pe inricchie e çellole inte trei çicli consecutivi. E çellole en stæte aliquotæ pe l’analixi de citometria de flusso (comme descrito chì de d’ato) e un mion de çellole en stæte aliquotæ træ vòtte pe l’analixi LC-MS/MS. I campioin son stæti elaboæ pe LC-MS/MS comme descrito ciù avanti. Noemme emmo stimou o valô do metabolito mancante con un numero de ioin de 1000. Ògni campion o vëgne normalizzou da-o numero totale de ioin (TIC), convertio logaritmicamente e normalizzou automaticamente inte MetaboAnalystR avanti de l'analixi.
A sospenscion de çellole sencia de tutti i paçienti a l’é stæta deslenguâ e filtrâ pe mezo de un filtro de 40 μm inte un mezzo completo (comme descrito chì de d’ato). Segondo o protocòllo do produttô, l’é stæto deuviou trei çicli consecutivi de seleçion poxitiva pe seperaçion magnetica de perle pe mezo de MicroBeads (Miltenyi) pe inricchie i campioin pe-e çellole CD8+, CD4+ e CD45- (in sciâ giassa). À dîla curta, e çellole vëgnan resuspeise inte un tampon d’inricchimento de çellole (comme descrito chì de d’ato) e vëgnan contæ. E çellole en stæte incubæ con de perlette CD8 umañe, perlette CD4 umañe ò perlette CD45 umañe (Miltenyi) à 4°C pe 15 menuti e dapeu en stæte lavæ con un tampon d’inricchimento de çellole. O campion o vëgne passou pe-a chinòlla LS (Miltenyi) e vëgne arrecuggeito e fraçioin poxitive e negative. Pe redue a duâ e mascimizzâ o passo de recupero de çellole, dapeu a fraçion CD8 a ven deuviâ pe-o segondo çiclo d’inricchimento CD4+ e a fraçion CD4 pe l’inricchimento CD45 succescivo. Mantegnî a soluçion in sciâ giassa pe tutto o proçesso de separaçion.
Pe inandiâ di campioin pe l'analixi di metaboliti, e çellole son stæte lavæ unna vòtta con unna soluçion de sâ freida comme a giassa e 1 ml de metanölo à l'80% o l'é stæto azzonto à ògni campion, dapeu vortexæ e congelæ à sciacco inte de l'azöto liquido. I campioin son stæti sottopòsti à trei çicli de zeo-desgheuggise e centrifugæ à 14.000 giri/min pe 15 menuti à 4°C. O sorvenatante ch’o contëgne i metaboliti o s’evapoa fin à secco. I metaboliti en stæti deslenguæ torna inte 50 μl d’açido formico a-o 0.03%, vortexæ pe mescciâli e dapeu çentrifugæ pe remeuve i detriti.
Estrae i metaboliti comme descrito chì de d’ato. Trasferî o sorvenatante inte unna bottiglia de cromotografia liquida à erta prestaçion pe-a reçerca in sciâ metabolomica. Addeuviâ un protocòllo de trattamento casuale pe trattâ ògni campion con unna quantitæ de çellole pægia pe prevegnî i effetti de lotto. Noemme emmo fæto unna valutaçion qualitativa di metaboliti globali pubricæ in passou in sciô spettrometro de massa à triplo quadrupòlo AB SCIEX QTRAP 5500 (50). L’analixi cromatografica e l’integraçion de l’area de çimma en stæte fæte pe mezo do software MultiQuant verscion 2.1 (Bioscistemi applicæ SCIEX).
Un numero de ioin de 1000 o l'é stæto addeuviou pe astimmâ o valô do metabolito ch'o l'ammanca e o TIC de ògni campion o l'é stæto addeuviou pe carcolâ l'area de çimma normalizzâ de ògni metabolito individuou pe correze i cangiamenti introduti da l'analixi strumentale da l'elaboraçion do campion. Dòppo a normalizzaçion do TIC, se deuvia MetaboAnalystR(51) (parametro predefinio) pe-a converscion logaritmica e a scâ automatica da linia de nòrma. Addeuviemmo o PCA co-o pacchetto R vegan pe effettuâ unn'analixi esplorativa de differense de metabòlomi tra-i tipi de campioin e emmo addeuviou unn'analixi de redondansa parçiale pe analizzâ i paçienti. Addeuviâ o metodo Ward pe construe un dendrogramma de mappa de calô pe mette insemme a distansa euclidea tra-i campioin. Noemme emmo deuviou limma (52) in sce l’abbondansa de metabòliti standardizzâ pe identificâ di metabòliti abbondanti de forma differensiale inte tutto o tipo de çellola e o microambiente. Pe semplificâ l'esplicaçion, addeuviemmo o parametro media do gruppo pe speçificâ o modello e piggiemmo i tipi de çellole into microambiente comme ògni gruppo (n = 6 gruppi); pe-o test de scignificato, emmo fæto træ mesue repetue pe ògni metabolito Pe schivâ unna fäsa replicaçion, o paçiente o l’é stæto compreiso comme un ostacolo into progetto do limma. Pe verificâ e differense inti metaboliti tra di paçienti despægi, emmo regolou o modello de limma, compreiso i paçienti, à un mòddo fisso. Segnalemmo o scignificato do contrasto prespeçificou tra o tipo de çellola e o microambiente de Padj <0.05 (correçion de Benjamini-Hochberg).
Dòppo l’inricchimento de vigoî pe mezo do Kit pe-a remoçion de çellole mòrte de Miltenyi (vitalitæ >80%), o sequensiamento do trascrittòma à çellola sencia o l’é stæto fæto in scî campioin d’ascite e de tumoî zeæ viventi totali pe mezo de un protocòllo d’esprescion genetica 10x 5′. L'é stæto analizzou çinque caxi con di tumoî e ascite correspondenti, sciben che a bassa vitalitæ de un campion de tumoî a l'à impedio a seu incluxon. Pe ottegnî ciù seleçioin de paçienti, emmo combinou i campioin de ciaschedun paçiente inte corsie do contròllo de cromo 10x e emmo analizzou l'ascite e i sciti do tumore pe conto seu. Dòppo o sequensiamento [Estremmitæ accobbiâ (PE) de 28×98 bp, genöma do Quebec; unna media de 73.488 e 41.378 lettue pe çellola pe tumore e ascite rispettivamente]], emmo deuviou CellSNP e Vireo (53) (basæ in sce CellSNP comme O SNP uman commun (VCF) fornio da GRCh38 o l’é assegnou unn’identitæ de genotipo donatô (stato identitæ de paçiente (IBS), sensa contegnî e çellole no assegnæ e e çellole identificæ comme duplexe e i donatoî correspondenti tra ascite e campioin de tumore (54), emmo conservou trei caxi con unna rappresentansa abbondante de çellole into tumore e inte l'ascite pe l'analixi à valle (ScCoran pa5) o l'à produto 6975 çellole (2792 e 4183 çellole da tumore e ascite, rispettivamente) pe l'analixi deuviemmo l'aggruppamento de Louvain de igraph (57) da ræ vexiña scompartia (SNN) basâ in sciâ distansa de Jaccard a-e çellole do gruppo pe mezo de l'esprescion de çellole basæ à man. e visualizzæ con t-SNE e çellole T citotòsciche en definie da l’esprescion de CD8A e GZMA, à l’escluxon di sottocluster con unna bassa esprescion de proteiñe ribosòmiche (16), compreiso o seu incorporaçion de t-SNE, peuan controllâ l’esprescion de çellole immunitäie.
I PBMC en stæti separæ da-i produti de seperaçion di leucoçiti (tecnologie STEMCELL) pe mezo da centrifugaçion à denscitæ de gradiente de Ficoll. E çellole CD3+ en stæte isoæ da-o PBMC pe mezo de perle CD3 (Miltenyi). In presensa ò in assensa de MNA, e çellole CD3+ vegnivan attivæ con CD3 ligou a-e placche (5 μg/ml), CD28 solubile (3 μg/ml) e IL-2 (300 U/ml; proleuchina). Inte l’urtimo giorno d’espanscion, a vitalitæ (tinte de vitalitæ fissabile eFluor450, eBiosciensa) e a proliferaçion (123 perle d’eContento, Thermo Fisher Scientific) en stæte valuæ pe mezo da citometria à flusso. Valuâ a fonçion de l’effettô stimolando e çellole con PMA (20 ng/ml) e ionomiçiña (1 μg/ml) con GolgiStop pe 4 oe e monitorâ a CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), a CD4-AF700 (RPA-T4) e a TNForetiscifTCana. (MAb11, BD). Stimolâ e çellole qPCR e ChIP con PMA (20 ng/ml) e ionomiçiña (1 μg/ml) pe 4 oe. O sorvenatante ELISA o l’é stæto recuggeito avanti e dòppo a stimolaçion con PMA (20 ng/ml) e ionomiçiña (1 μg/ml) pe 4 oe.
Segue o protocòllo do produttô pe isolâ l’RNA pe mezo do mini kit RNeasy Plus (QIAGEN). Addeuviâ o trituratô QIA (QIAGEN) pe omogeneizzâ o campion. Deuviâ o kit d’RNA à cDNA d’erta capaçitæ (Thermo Fisher Scientific) pe scintetizzâ o DNA complementare (cDNA). Deuviâ a mescciua master avansâ spedia TaqMan (Thermo Fisher Scientific) pe quantificâ l’esprescion genica (segondo o protocòllo do produttô) co-e sonde che vëgnan apreuvo: Hs02786624_g1 [gliceraldeide-3-fosfato feua idrògeno (GAPDH)] e Hs01010726_m1 (SLC22A2). I campioin son stæti exeguii in sciô scistema PCR in tempo reale StepOnePlus (Bioscistemi applicæ) (Bioscistemi applicæ) inta placca de reaçion ottica spedia à 96 possetti MicroAmp (Bioscistemi applicæ) con un film ottico MicroAmp. Quarche valô de Ct ch’o passa o 35 o l’é tegnuo pe ëse ciù erto che o livello de relevaçion e o l’é marcou comme no relevâ.
Exeguî o ChIP comme descrito in passou (58). À dîla curta, e çellole en stæte trattæ con do formaldeide (conçentraçion finale 1,42%) e incubæ à temperatua ambiente pe 10 menuti. Utilizzâ un tampon de gonfiamento supplementou (25 mM de Hepes, 1,5 mM de MgCl2, 10 mM de KCl e 0,1% de NP-40) in sciâ giassa pe 10 menuti, e dapeu sospendelo torna inte un tampon d’immunopreçipitaçion comme descrito (58). O campion o l'é stæto donca sonificou co-i çicli che vëgnan apreuvo: 10 çicli (20 impulsi de 1 segondo) e un tempo statico de 40 segondi. Incubâ di anticòrpi d’immunoglobuliña G de livello ChIP (tecnologia de segnalaçion çellolare; 1μl), istöni H3 (tecnologia de segnalaçion çellolare; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) e SP1 (tecnologia de segnalaçion çellolare; 3μl) co-o campion à peiso de 4°CC Incubâ e perle de proteiña A (Thermo Fisher Scientific) co-o campion à 4°C con agitâlo delicatamente pe unn'oa, dapeu deuviâ e perle de chelex (Bio-Rad) pe inricchie o DNA e deuviâ a proteiñaxi K (Thermo Fisher) pe-a digestion de proteiñe. O promotô TNFα o l’é stæto individuou pe PCR: avanti, TGT TGT TGT TGT; a-o conträio, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (produto à 207 bp). E immagine en stæte produte da-o Image Lab (Bio-Rad) e quantificæ con deuviâ o programma ImageJ.
O sorvenatante da coltua de çellole o l’é stæto recuggeito comme descrito chì de d’ato. A determinaçion a l’é stæta fæta segondo e proçedue do produttô do kit ELISA TNFα uman (Invitrogen), kit ELISA IL-2 uman (Invitrogen) e kit ELISA IFN-γ uman (Abcam). Segondo o protocòllo do produttô, o sorvenatante o l’é stæto diluio 1:100 pe relevâ TNFα e IL-2 e 1:3 pe relevâ IFN-γ. Pe mesuâ a sciorbensa à 450 nm, deuviæ o lettô con ciù marche EnVision 2104.
I PBMC en stæti separæ da-i produti de seperaçion di leucoçiti (tecnologie STEMCELL) pe mezo da centrifugaçion à denscitæ de gradiente de Ficoll. E çellole CD3+ en stæte isoæ da-o PBMC pe mezo de perle CD3 (Miltenyi). In presensa ò in assensa de MNA, e çellole CD3+ en stæte attivæ con CD3 ligou a-e placche (5 μg/ml), CD28 solubile (3 μg/ml) e IL-2 (300 U/ml; proleuchina) pe 3 giorni. Dòppo 3 giorni, e çellole en stæte arrecuggeite e lavæ con do 0.9% de soluçion salina e o pellet o l’é stæto congelou à sciacco. O conteggio de çellole o l’é stæto fæto pe mezo da citometria à flusso (configuraçion 3L-16V-14B-8R) pe mezo de 123 perle eBeads.
Estrae i metaboliti comme descrito chì de d’ato. L’estratto secco o l’é stæto reconstituio à unna conçentraçion de 4000 equivalenti de çellole/μl. Analizzâ o campion pe mezo da cromotografia à fase inversa (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, California) e da chinòlla CORTECS T3 (2,1 × 150 mm, dimenscion de partiçelle 1,6 μm, dimenscion di pöri 120 Å; ægue). Spettròmetro de massa polare (6470, Agilent), donde a ionizzaçion à elettrospray a fonçioña in modalitæ poxitiva. A fase mòbile A a l’é 0.1% d’açido fòrmico (inte H2O), a fase mòbile B a l’é 90% d’açetonitrilo, 0.1% d’açido fòrmico. O gradiente LC o l'é da 0 à 2 menuti pe-o 100% A, da 2 à 7,1 menuti pe-o 99% B e da 7,1 à 8 menuti pe-o 99% B. Dapeu mette in equilibrio torna a chinòlla co-a fase mòbile A à un tasso de portâ de 0,6 ml/min pe 3 menuti. . O tasso de portâ o l'é de 0.4ml/min, e a camia da chinòlla a ven rescädâ à 50°C. Deuviâ o standard chimico puo de MNA (M320995, Soçietæ chimica de reçerca de Toronto, North York, Ontario, Canada) pe stabilî o tempo de retençion (RT) e a trasformaçion (RT = 0,882 menuti, trasformaçion 1 = 137→94,1, trasformaçion 2 = 137→1237). Quande tutte e træ tranxiçioin se verifican into tempo de retençion corretto, a tranxiçion 1 a ven deuviâ pe-a quantificaçion pe garantî a speçificitæ. A curva standard de MNA (Soçietæ chimica de reçerca de Toronto) a l’é stæta generâ da sëi diluiçioin in serie da soluçion de stock (1 mg/ml) pe ottegnî di standard de 0,1, 1,0, 10 e 100 ng/ml e 1,0 e 10 μg/ml liquido rispettivamente. O limite de relevaçion o l’é de 1 ng/ml e a respòsta lineare a l’é tra 10 ng/ml e 10 μg/ml. Ògni inieçion de doî microlitri de campion e standard a vëgne addeuviâ pe l'analixi LC/MS e un campion de contròllo da qualitæ mesccio o vëgne exeguio ògni eutto inieçioin pe garantî a stabilitæ da ciattaforma d'analixi. E respòste MNA de tutti i campioin de çellole trattæ con MNA ean drento de l'intervallo lineare de l'analixi. L'analixi di dæti a l'é stæta fæta con deuviâ un programma d'analixi quantitativa MassHunter (v9.0, Agilent).
O costruto αFR-CAR de segonda generaçion o l’é stæto piggiou da Song et al. (59). À dîla curta, o costruto o contëgne i contegnui che vëgnan apreuvo: sequensa de leader CD8a, frammento variabile à cadeña sencia speçifico pe αFR de l’òmmo, çernia CD8a e region trasmembraña, dominio intraçellolare CD27 e dominio intraçellolare CD3z. A sequensa CAR completa a l’é stæta scintetizzâ da GenScript e dapeu clonâ into vettô d’esprescion lentivirale de segonda generaçion à montâ da cassetta d’esprescion GFP deuviâ pe valuâ l’effiçensa da trasduçion.
O lentivirus o ven produto pe trasfeçion de çellole HEK293T [Colleçion de coltue de tipo americaña (ATCC); cortivou inte un mezzo Eagle modificou da Dulbecco ch’o contëgne o 10% de særo bovin fetale (FBS) e l’1% de PenStrep, e o l’à deuviou o vetô CAR-GFP e i plasmidi d’imballaggio (psPAX2 e pMD2.G, Addgene) deuvian l’amina de lipofeçion (Sigma-Aldrich). O sorvenatante ch’o contëgne o virus o l’é stæto recuggeito 48 e 72 oe dòppo a trasfeçion, filtrou e conçentrou pe ultraçentrifugaçion. Conservâ o sorvenatante virale conçentrou à -80°C fin a-a trasduçion.
I PBMC vëgnan separæ da-i produti de seperaçion di leucoçiti donatoî sani (tecnologie STEMCELL) pe mezo da centrifugaçion à denscitæ de gradiente de Ficoll. Deuviâ de microperle CD8 de seleçion poxitiva (Miltenyi) pe isolâ e çellole CD8+ da-o PBMC. Stimolâ e çellole T con TransAct (Miltenyi) e inte un mezzo TexMACS [Miltenyi; supplementou co-o 3% de særo uman inattivou da-o cado, l’1% de PenStrep e IL-2 (300 U/ml)]. Vintiquattro oe dòppo a stimolaçion, e çellole T en stæte trasdute con lentivirus (10 μl de sorvenatante conçentrou de virus pe 106 çellole). Da 1 à 3 giorni dòppo a trasduçion in sce Cytek Aurora (in sce FSC (diffuxon avanti)/SSC (diffuxon laterale), Singlet, GFP+), valuâ l’esprescion de GFP de çellole pe demostrâ unn’effiçensa de trasduçion a-o manco do 30%.
E çellole CAR-T en stæte cortivæ pe 24 oe inte Immunocult (tecnologie STEMCELL; supplementæ con l’1% de PenStrep) inte condiçioin che vëgnan apreuvo: no trattæ, trattæ con 250 μM d’adenosiña ò 10 mM de MNA. Dòppo o pretrattamento, e çellole CAR-T en stæte lavæ con PBS e combinæ con 20.000 çellole SK-OV-3 [ATCC; in sce un mezzo McCoy 5A (Sigma-Aldrich) supplementou co-o 10% de FBS e l’1% de PenStrep à 10: o rappòrto effettô/bersalio de 1 o l’é stæto amplificou in triplicato inte un mezzo immunocult supplementou. E çellole SK-OV-3 e e çellole SK-OV-3 lisæ con saponiña digitalis (0,5 mg/ml; Sigma-Aldrich) en stæte deuviæ comme contròlli negativi e poxitivi rispettivamente. Dòppo 24 oe de co-cortivaçion, o sorvenatante o l’é stæto recuggeito e a lattato deidrogenaxi (LDH) a l’é stæta mesuâ segondo e istruçioin do produttô (Kit d’analixi de citotosciçitæ Glo LDH, Promega). O sorvenatante de LDH o l’é stæto diluio 1:50 inte un tampon de LDH. A perçentuale d’ammassâ a l’é stæta mesuâ pe mezo da formola chì apreuvo: perçentuale d’ammassâ = perçentuale de correçion / tasso mascimo d’ammassâ x 100%, donde a perçentuale de correçion = solo che çellole T de co-coltua, e tasso mascimo d’ammassâ = contròllo poxitivo-controllo negativo.
Comme l’é descrito into testo ò inti mateiæ e inti metodi, deuviâ GraphPad Prism 8, Microsoft Excel ò R v3.6.0 pe l’analixi statistica. Se vëgne arrecuggeito ciù campioin da-o mæximo paçiente (comme ascite e tumore), addeuviemmo un test t in cobbia ò comprendemmo o paçiente comme effetto casuale inte un modello lineare ò generalizzou comme appropiou. Pe l’analixi metabòlica, o test d’importansa o ven fæto in triplicato.
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O MNA o contribuisce a-a sopprescion immunitäia de çellole T e o representa un potençiale obiettivo d’immunoterapia pe-o trattamento do cancro de l’òmmo.
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©2021 Assoçiaçion americaña pe-o progresso da sciensa. tutti i driti reservai. AAAS o l'é un compagno de HINARI, AGORA, OARE, CÒRO, ORLOGISS, Referimenti incroxæ e CONTATÔ. I progresci da sciensa ISSN 2375-2548.