A classificaçion de proteiñe into percorso secretöio a l’é essençiale pe mantegnî a compartimentaçion e l’omeostaxi de çellole. In azzonta a-a classificaçion mediâ da-e scheuggioe, o ròllo di lipidi inta classificaçion da cinesiña into proçesso de traspòrto secretöio a l’é unna domanda de base de longa data ch’a no l’à ancon avuo unna respòsta. Chì s’effettua de imaging 3D contemporanei à tempo reale à erta resoluçion multicolore pe demostrâ in vivo che e proteiñe immobilizzæ da-o glicosilfosfatidilinoscitolo scintetizzæ da neuva con de fraçioin de lipidi de ceramide assæ longhe vëgnan aggruppæ e clascificæ inte di endoplasmi speçializzæ da-o scito de sciortia de trasmembra, ch’o l’é. Pe de ciù, demostremmo che a longhixe da cadeña da ceramida inta membraña do reticolo endoplasmico a l’é fondamentale pe sta selettivitæ de classificaçion. O nòstro studio o fornisce a primma preuva diretta in vivo pe clascificâ e carreghe de proteiñe basæ in sciâ longhixe da cadeña di lipidi inte di sciti d’esportaçion selettivi into percorso secretöio.
Inte çellole eucariöte, e proteiñe scintetizzæ into reticolo endoplasmico (ER) dapeu vëgnan ordenæ durante o traspòrto pe-o percorso secretöio pe-a consegna a-a seu destinaçion çellolare appropriâ (1). In azzonta a-a classificaçion mediâ da-o mantello, s’é ipotizzou pe longo tempo che çerti lipidi peuan servî ascì da ponti de sciortia selettivi, aggruppandoli inte di dominni speçifichi de membraña che de proteiñe speçifiche (2-5). À tutti i mòddi, gh’é ancon unna mancansa de preuve dirette in vivo pe demostrâ sto poscibile mecanismo basou in scî lipidi. Pe resòlve sto problema de base, emmo studiou into levou comme e proteiñe ancoræ a-o glicosilfosfatidilinoscitolo (GPI) (GPI-AP) vëgnan esportæ de forma differensiale da l’ER. I GPI-AP en unna varietæ de proteiñe da superfiçie de çellole ligæ a-i lipidi ( 6, 7). GPI-AP a l’é unna proteiña secreta attaccâ a-i feuggi esterni da membraña do plasma pe mezo da porçion glicolipidica (ancora GPI). Açettan i ancoî GPI comme modifiche conservatoe pòst-traslaçionale into lumen ER (8). Dòppo l’attacco, o GPI-AP o passa pe l’apparecchio de Golgi (5, 9) da l’ER a-a membraña do plasma. A presensa d’ancoe GPI a pòrta a-o traspòrto de GPI-AP pe conto seu da-e proteiñe secrete da trasmembraña (compreiso de atre proteiñe da membraña do plasma) longo o percorso secretöio (5, 9, 10). Inte çellole do levou, i GPI-AP vëgnan separæ da atre proteiñe secrete into reticolo endoplasmico e dapeu vëgnan imballæ inte de vescicole uniche inguggeite da-o complesso de proteiñe do mantello II (COPII) (6, 7). I determinanti de sto proçesso de clascificaçion into proçesso d’esportaçion ER no en ciæi, ma se pensa che sto mecanismo o pòsse avei de beseugno de lipidi, mascime a remodellaçion strutturale da porçion lipidica de l’ancora GPI (5, 8). Into levou, o remodellamento di lipidi do GPI o comensa subito dòppo che o GPI o s’attacca e inte tanti caxi o pòrta a-o ligamme da ceramida à l’açido grasso satou à cadeña longa de 26 carbòni (C26:0) (11, 12). A ceramide C26 a l’é a ceramide prinçipâ produta da-e çellole do levou fin à oua. O ven scintetizzou inte l’ER e a ciù parte a ven esportâ inte l’apparecchio de Golgi pe mezo de vescicole COPII (13). L’esportaçion ER de GPI-AP a domanda into dettaggio unna scintexi de ceramide continua (14, 15) e à seu vòtta a converscion da ceramide inte ceramide de fosfato d’inoxitolo (IPC) inte l’apparecchio de Golgi a depende da-a scintexi de l’ancora de GPI (16). Di studdi biofixichi con de membrañe artifiçiale an demostrou che e ceramide à cadeña açilica assæ longa peuan coalesce pe formâ di dominni ordinæ con de propietæ fixiche uniche (17, 18). Sti dæti pòrtan à l’ipòtexi che a ceramida C26 e GPI-AP co-a ceramida C26 deuvian e seu propietæ fixiche pe coalesce inte de regioin ò regioin ordinæ inte l’ambiente lipidico de membraña ER relativamente invexendou. O l’é compòsto pe-o ciù da di glicerolipidi curti e insatuæ (C16:1 e C18:1) (19, 20). Ste regioin saian conçentræ selettivamente in sce di sciti speçifichi de sciortia ER (ERES), donde a ceramida e o GPI-AP basou in sciâ ceramida peuan vegnî co-trasportæ a-o Golgi inta mæxima vescicola COPII dedicâ (5).
Inte sto studio emmo verificou direttamente sto meccanismo basou in scî lipidi pe mezo da microcoscopia d’imaging confocale in tempo reale à superresoluçion (SCLIM), ch’a l’é unna tecnica de microcoscopia d’avanguardia ch’a peu osservâ a-o mæximo tempo de proteiñe marcæ à fluorescensa. (21, 22).
Pe-a primma vòtta emmo applicou a tecnologia SCLIM pe definî de ciù comme o GPI-AP normale co-o gruppo de ceramide C26 o l’é stæto screenou da de proteiñe secrete trasmembrañe dòppo avei lasciou l’ER inte S. cerevisiae. Pe controllâ a clascificaçion de l’ER, emmo deuviou un scistema genetico ch’o peu visualizzâ direttamente a carrega scintetizzâ da neuva ch’a l’intrâ inte l’ERES in vivo (7, 23). Comme cargo, emmo çernou GPI-AP Gas1 à base de ceramide C26 marcou con unna proteiña fluorescente verde (GFP) e a proteiña secreta da trasmembraña Mid2 marcâ con unna proteiña fluorescente à infrarosci squæxi (iRFP), tutte doe che miran a-a membraña do plasma (24-26). Into mutante sec31-1 senscibile a-a temperatua, ste doe carreghe en espresse sotta un promotô ch’o peu indue o galattòsio e un marcatô ERES constitutivo. A-a temperatua estrema (37°C), dæto che a mutaçion sec31-1 a l’influisce in sciâ fonçion do componente do mantello COPII Sec31 pe inibî a germinaçion de COPII e l’esportaçion de ER, a carrega scintetizzâ da neuva a s’ammuggia inte l’ER (23). Dòppo ëse stæti freidi à unna temperatua bassa (24°C), e çellole mutante sec31-1 se son repiggiæ da l’area secretöia e a neuva carrega scintetica ammuggiâ a l’à comensou à vegnî esportâ da l’ER. A vixoalizzaçion CLIM a l’à demostrou che a ciù parte di Gas1-GFP e Mid2-iRFP scintetizzæ da neuva s’ammuggian ancon inte l’ER de çellole mutante sec31-1 dòppo l’incubaçion à 37°C e dapeu relasciæ à 24°C pe 5 menuti (figua 1). Dæto che Mid2-iRFP o se distribuisce in sce tutta a membraña ER e Gas1-GFP o se conçentra e o s’arrecugge inte l’area discontinua da membraña ER, a seu distribuçion a l’é do tutto despægia (figua 1, da A à C e Movie S1). Pe de ciù, comme se vedde inta figua 1D, o gruppo Gas1-GFP o no l’à Mid2-iRFP. Sti resultati indican che e proteiñe GPI-AP e trasmembrañe en stæte separæ fito inte diverse regioin de membrañe ER. O gruppo Gas1-GFP o l’é vexin à un ERES speçifico marcou co-a proteiña do mantello COPII de mCherry Sec13 (figua 1, E e F, e film S1) (23).
E çellole sec31-1 esprimman de secreçioin indute da-o galattòsio, unna longa cadeña açilica (C26) ceramida GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, verde) e a proteiña trasmembraña Mid2-iRFP (TMP, bleu) e sta marcatua construttiva ERES a l’é stæta magnâ à Sec13-mCherry (ER30). menuti, mesciæ à 24°C e representæ da-o SCLIM 5 menuti apreuvo. (A à C) o mostra unn’imagine 2D representativa fusa ò sencia de un cian (A), unn’imagine de proieçion 2D de 10 seçioin z (B) ò unn’imagine 3D d’emisfëio de çellole de cargo e marcatoî ERES (C). Barra de scâ 1μm (A e B). L’unitæ de scâ a l’é de 0.551 μm (C). Gas1-GFP o l’é stæto individuou inte de regioin ò cluster ER discreti, mentre Mid2-iRFP o l’é stæto individuou e distribuio inte tutta a membraña ER (C). (D) O grafico o mostra l’intensitæ relativa de fluorescensa de Gas1-GFP e Mid2-iRFP into gruppo Gas1-GFP longo a linia da freccia gianca (à manciña). AU, unitæ arbiträia. (E e F) rappresentan l'imagine 3D ch'a combiña a mercançia e o marco ERES. I gruppi Gas1-GFP en stæti individuæ vexin à l’ERES speçifico. L’unitæ de scâ a l’é de 0.551 μm. (F) A freccia sòlida gianca a marca o gruppo Gas1-GFP assoçiou à ERES. I pannelli de mezo e de drita mostran l’imagine 3D ingrandia fusa e unna vixon rotâ do cluster Gas1-GFP seleçionou.
A streita relaçion spaçiale tra o gruppo Gas1-GFP e un ERES speçifico a l’indica che Gas1-GFP o peu intrâ inte un ERES selettivo, ch’o l’é despægio da-a selettivitæ deuviâ da Mid2-iRFP pe lasciâ l’ER. Pe affrontâ sta poscibilitæ, emmo quantificou o rappòrto ERES pe un ò doî ben solo (figua 2, da A à C). Noemmo l'é stæto nottou che i ciù tanti ERES (70%) contëgnan solo che unna meña de carrega. L’imagine in fondo da figua 2C a mostra doî exempi tipichi de ERES con solo che Gas1-GFP (figua 1) ò solo che Mid2-iRFP (figua 2). Pe contra, pöco assæ o 20% de l'ERES o contëgne doe carreghe che se creuvan uña con l'atra inta mæxima aria. L'é stæto nottou che çerti ERES (10%) contegnivan doe qualitæ de carreghe, ma ean isoæ inte de aree ciæamente despæge. De conseguensa, st’analixi statistica a mostra che dòppo l’esportaçion de l’ER, o Gas1-GFP GPI-AP e o cargo trasmembrano Mid2-iRFP se dividdan inte diversci ERES (figua 2D). St’effiçensa de classificaçion a l’é ben ben coerente con l’analixi biochimica preçedente (6) e a determinaçion morfològica (7). Nosciatri poemmo ascì osservâ o comportamento da carrega in quarantena ch'a l'intrâ inte l'ERES (figua 2E e film S2). A figua 2E a mostra che solo che unna porçion picciña de Gas1-GFP (pannello 3) ò Mid2-iRFP (pannello 4) a l’intrâ inte l’ERES da unna parte e a l’é confinâ inte unn’area discreta. O pannello 5 da figua 2E o mostra che Gas1-GFP e Mid2-iRFP de vòtte s’attreuvan inti mæximi ERES, ma intran da di loei despægi e se conçentran inte de regioin separæ che peuan rappresentâ de vescicole COPII despæge. Noemme emmo confermou ascì che a seperaçion e a clascificaçion osservæ de GPI-AP Gas1 basou in sciâ ceramide C26 comme ERES selettivo a l’é speçifica perché unn’atra carrega de secreçion trasmembraña, a proteiña de membraña plasmatica marcâ con GFP Axl2 (27), a mostra un comportamento ch’o s’assumeggia à quello de Mid2-iRFP. (Immagine S1 e Cinema S3). Axl2-GFP scintetizzou da neuva o se distribuisce atraverso da membraña ER comme Mid2-iRFP (figua S1, A e B) e o l’é co-localizzou con Mid2-iRFP inta ciù parte di ERES (figua S1, da-o B a-o D). I pannelli 1 e 2 da figua 1. S1C o mostra doî exempi tipichi de ERES donde doe carreghe trasmembrañe se creuvan uña in sce l’atra. Inte sti caxi, tutte doe e mercançie intran inte l'ERES insemme (figua S1E, pannello 3 e film S3).
E çellole sec31-1 ch’esprimman de secreçioin induçibile da galattòsio, Gas1-GFP (GPI-AP, verde) e Mid2-iRFP (TMP, bleu) e l’etichettatua ERES constitutiva ch’a marca Sec13-mCherry (ERES, magenta) en stæte misse à 37 Dòppo ëse incubæ à 37 °C à 30 menuti. blocco, e immagine con SCLIM dòppo 20 menuti. (A à C) Immagine de proieçion 2D representative (A; barra in scâ, 1μm) ò immagine d’emisfëio de çellole 3D (B e C; unitæ in scâ, 0.456μm) do cargo e 10 seçioin z marcæ da ERES. O pannello ciù basso inte (B) e o pannello inte (C) mostran de immagine elaboæ pe mostrâ solo i ben presenti inte ERES (magenta) [Gas1-GFP (grixo) e Mid2-iRFP (bleu ciæo)]. (C) Freccia averta: ERES o pòrta solo che un tòcco de carrega (da-o 1 a-o 4). Freccia grixa: ERES o contëgne de carreghe segregæ (5). Freccia masciscia gianca: ERES ch'o contëgne de carreghe co-locæ. De sotta: l’ERES sencio seleçionou o contëgne solo che Gas1-GFP (1) ò Mid2-iRFP (2). Barra de scâ, 100 nm. (D) Quantificaçion da fotomicrografia descrita into (C). A perçentuale media de ERES ch'a contëgne solo che unna carrega (Gas1-GFP ò Mid2-iRFP), carreghe segregæ e carreghe che se creuvan uña in sce l'atra. Inte trei esperimenti independenti, n=432 inte 54 çellole. Barra d’errô = SD. Test t no accobbiou à doe coe. *** P = 0,0002. (E) Immagine 3D de ERES seleçionæ de carreghe in quarantena marcæ co-o (C). O Gas1-GFP (verde) (3) ò o Mid2-iRFP (bleu) (4) o l’intrâ inte l’ERES (magenta) da unna parte e o l’é restreito à unn’area picciña drento de l’ERES. De vòtte, tutte doe e qualitæ de carreghe intran into mæximo ERES (5) da-a mæxima banda e son confinæ inte unn'aria isoâ drento l'ERES. Barra de scâ, 100 nm.
Pe avanti, emmo verificou unn’ipòtexi che a ceramida à longa cadeña açilica (C26) presente inta membraña ER a pòrte à l’aggruppamento e a-a classificaçion speçifica de Gas1 inte ERES selettivi. Pe sta finalitæ emmo deuviou un çeppo de levou modificou GhLag1, donde e doe scintaxi endògene de ceramide Lag1 e Lac1 en stæte sostituie da GhLag1 (l’omòlogo Lag1 do cotton), co-o resultato de un çeppo de levou con un çeppo de membraña çellolare Ceramide ciù curto che o tipo sarvægo (figua 3A) (2). L’analixi da spettrometria de massa (MS) a l’à demostrou che inti çeppi de tipo sarvægo, o 95% da ceramida totale a l’é unna ceramida à cadeña assæ longa (C26), mentre inte GhLag1 l’85% da ceramida a l’é assæ longa (C18 e C16). ), solo o 2% da ceramida a l’é ceramida à cadeña assæ longa (C26). Sciben che e ceramide C18 e C16 son e ceramide prinçipæ stæte relevæ inta membraña GhLag1 fin à oua, l’analixi MS a l’à confermou ascì che l’ancora GPI de Gas1-GFP espresso into çeppo GhLag1 o contëgne a ceramide C26, ch’a se peu confrontâ co-i lipidi de tipo sarvægo. A qualitæ a l’é a mæxima (fig. 3A) (26). De conseguensa, questo o veu dî che l’enzima de remodelaçion da ceramida Cwh43 o l’é assæ selettivo pe-a ceramida C26, comme se vedde inta figua 26, e o l’incorpoa de preferensa l’ancora GPI da unna quantitæ picciña de ceramida C26 into çeppo GhLag1. S2 (29). À tutti i mòddi, a membraña çellolare de GhLag1 a contëgne solo che a ceramida C18-C16, mentre Gas1-GFP o l’à ancon a ceramida C26. Sto fæto o rende sto çeppo un strumento ideale pe resòlve into dettaggio o problema da longhixe da cadeña açilica da ceramide de membraña inte l’ER. O ròllo ipotetico da classe e da classificaçion. Dapeu emmo studiou pe-a primma vòtta a capaçitæ de C26 Gas1-GFP d’ammuggiâse inte di gruppi inte GhLag1 con un allele mutante senscibile a-a temperatua de sec31-1 pe mezo da microcoscopia à fluorescensa convençionale, donde existe solo che a cadeña longa (C18-C16) inta ceramide de membraña ER (fig. 3). Noemmo l’emmo osservou che inta sec31-1 a ciù parte do Gas1-GFP a l’ea conçentrâ inte di gruppi, mentre o Gas1-GFP inta sec31-1 GhLag1 con unna membraña ER de ceramide longa (C18-C16) longa pe-o ciù o no l’ea aggruppou e distribuio inte tutta a membraña ER. Pe ëse preçixi, dæto che o clustering basou in sciâ ceramide C26 o l’é ligou streitamente à di ERES speçifichi (figua 1), emmo studiou dapeu se sto proçesso o peu coinvòlze ascì a fonçion do mecanismo de proteiñe d’esportaçion ER. GPI-AP o deuvia un scistema particolâ COPII pe l’esportaçion ER, ch’o l’é regolou attivamente da-o remodellamento strutturale de Ted1 da porçion glicanica de l’ancora GPI (30, 31). Dapeu o glican GPI recombinante o ven reconosciuo da-o complesso p24 do reçettô de cargo trasmembrano, ch’o recluta à seu vòtta selettivamente Lst1, ch’a l’é unn’isoforma speçifica da sottounitæ de ligamme do cargo COPII prinçipâ Sec24, formando unna vescicole COPII ricca de GPI-AP (33). De conseguensa, emmo costruto un mutante doggio ch’o l’à combinou a deleçion de ste proteiñe sence (o componente complesso p24 Emp24, l’enzima de remodellaçion do glican GPI Ted1 e a sottounitæ speçifica COPII Lst1) co-o çeppo mutante sec31-1 e ê emmo studiæ. Noemmo l’emmo osservou che inta sec31-1emp24Δ e inta sec31-1ted1Δ, o Gas1-GFP o no l’é pe-o ciù aggruppou e o l’é distribuio inte tutta a membraña ER, comme l’é stæto visto primma inta sec31-1 GhLag1, mentre inta sec31-1lst1Δ, o Gas1-GFP o l’é comme sec3. Sti resultati indican che, ciù in là da presensa de ceramide C26 inta membraña ER, l’aggruppamento de Gas1-GFP o l’à de beseugno ascì de ligâse a-o complesso p24 e o no domanda un reclutamento speçifico de Lst1. Dapeu emmo esplorou a poscibilitæ che a longhixe da cadeña da ceramide inta membraña ER a pòsse regolâ o ligamme de Gas1-GFP à p24. À tutti i mòddi, emmo nottou che a presensa de ceramide C18-C16 inta membraña a no l’influisce in scî glicani GPI reconstruti da-o complesso p24 (figue S3 e S4, A e B) ò in sciô ligamme à GPI-AP e in sce l’esportaçion de GPI-AP. abilitæ. Reclutâ o sottotipo COPII Lst1 (figua S4C). De conseguensa, l’aggruppamento dependente da ceramide C26 o no domanda de interaçioin proteiche con diversci meccanismi d’esportaçion de proteiñe ER, ma o sostëgne un mecanismo de classificaçion alternativo guiddou da-a longhixe di lipidi. Dapeu emmo analizzou se a longhixe da cadeña açilica de ceramide inta membraña ER a l’é importante pe-a clascificaçion efficaçe de Gas1-GFP comme ERES selettivo. Dæto che Gas1 into çeppo GhLag1 co-a ceramide à cadeña curta o lascia l’ER e o l’intrâ inta membraña do plasma (figua S5), creddemmo che se a classificaçion a l’é guiddâ da-a longhixe da cadeña açile de ceramide, o Gas1 into çeppo GhLag1 o peu vegnî reindirizzou e incroxou. Mercançie ERES co-a mæxima membraña.
(A) A membraña de çellole de GhLag1 a contëgne pe-o ciù de ceramide C18-C16 ciù curte, mentre l’ancora GPI de Gas1-GFP o l’à ancon o mæximo IPC C26 de çellole de tipo sarvægo. De d’ato: analixi da longhixe da cadeña açilica da ceramide inta membraña de çellole di çeppi de tipo sarvægo (Wt) e GhLag1p pe spettrometria de massa (MS). I dæti representan a perçentuale de ceramide totale. A media de trei esperimenti independenti. Barra d’errô = SD. Test t no accobbiou à doe coe. **** P <0,0001. Pannello de sotta: analixi MS da longhixe da cadeña açilica de l’IPC presente inte l’ancora GPI Gas1-GFP (GPI-IPC) espressa inti çeppi de tipo sarvægo e GhLag1p. I dæti representan a perçentuale do segnâ IPC totale. Media de çinque esperimenti independenti. Barra d’errô = SD. Test t no accobbiou à doe coe. ns, no l'é importante. P = 0,9134. (B) I micrografi à fluorescensa de çellole sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ e sec31-1lst1Δ ch’esprimman Gas1-GFP induto da-o galattòsio en stæti incubæ à 37°C e à unna forma de passaggio de routine dòppo i 24°C. Freccia gianca: gruppo ER Gas1-GFP. Freccia averta: Gas1-GFP no raggruppæ o se distribuisce in sce tutta a membraña ER, e o mostra a coloraçion caratteristica de l’anello nucleare de l’ER. Barra de scâ, 5μm. (C) Quantificaçion da fotomicrografia descrita into (B). A perçentuale media de çellole con unna struttua Gas1-GFP pontâ. Inte trei esperimenti independenti, n≥300 çellole. Barra d’errô = SD. Test t no accobbiou à doe coe. **** P <0,0001.
Pe resòlve direttamente sto problema, emmo fæto unna vixoalizzaçion SCLIM de Gas1-GFP e Mid2-iRFP inte GhLag1 con l’allele mutante sec31-1 senscibile a-a temperatua (figua 4 e film S4). Dòppo che l’ER o l’é stæto trattegnuo à 37°C e dapeu relasciou à 24°C, a ciù parte do Gas1-GFP scintetizzou da neuva o no s’é misso insemme e distribuio inte tutta a membraña de l’ER, comme osservou da-i microscòppi convençionali (figua 4, A e B). Pe de ciù, unna gran fraçion de ERES (67%) a comprende doe qualitæ de carreghe co-locæ drento de lê (figua 4D). I pannelli 1 e 2 da figua 4C mostran doî exempi tipichi de ERES con Gas1-GFP e Mid2-GFP che se creuvan uña in sce l’atra. Pe de ciù, tutti doî i ben son stæti recrutæ into mæximo ERES (figua 4E, pannello 3 e cine S4). De conseguensa, i nòstri resultati indican che a longhixe da cadeña açile de ceramide inta membraña ER a l’é un determinante importante de l’aggregaçion e da clascificaçion de proteiñe ER.
E çellole GhLag1 Sec31-1 ch’esprimman de secreçioin indute da-o galattòsio, o Gas1-GFP (GPI-AP, verde) e o Mid2-iRFP (TMP, bleu) e o Sec13-mCherry constitutivo marcou con ERES (ERES, magenta) vëgnan incubæ à 37°C. Continuâ pe 30 menuti, fâ cazze a-i 24°C pe relasciâ de secreçioin e imagine con SCLIM dòppo 20 menuti. (A à C) Immagine de proieçion 2D representative (A; barra in scâ, 1μm) ò immagine d’emisfëio de çellole 3D (B e C; unitæ in scâ, 0.45μm) de 10 seçioin z marcæ da cargo e ERES. O pannello ciù basso inte (B) e o pannello inte (C) mostran de immagine elaboæ pe mostrâ solo i ben presenti inte ERES (magenta) [Gas1-GFP (grixo) e Mid2-iRFP (bleu ciæo)]. (C) Freccia impia gianca: ERES, mercançie se sovrapòñan. Freccia averta: ERES o contëgne solo che un elemento. Pannello ciù basso: l'ERES seleçionou o l'à de mercançie sovrapòste (1 e 2) marcæ into (C). Barra de scâ, 100 nm. (D) Quantificaçion da fotomicrografia descrita into (C). Inte unitæ GhLag1 sec31-1 e sec31-1 l’é compreiso solo che unna carrega (Gas1-GFP ò Mid2-iRFP) e a perçentuale media de ERES pe carreghe isoæ e carreghe sovrapòste. Inte trei esperimenti independenti, n = 432 inte 54 çellole (sec31-1) e n = 430 inte 47 çellole (sec31-1 GhLag1). Barra d’errô = SD. Test t no accobbiou à doe coe. *** P = 0,0002 (sec31-1) e ** P = 0,0031 (sec31-1 GhLag1). (E) Immagine 3D de ERES seleçionæ con un cargo sorvepòsto (3) marcou inte (C). Gas1-GFP (verde) e Mid2-iRFP (bleu) s’avvexiñan à l’ERES (magenta) da-o mæximo canto e arrestan inta mæxima area restreita à l’ERES. Barra de scâ, 100 nm.
Sto studio o fornisce de preuve dirette in vivo che e carreghe de proteiñe basæ in scî lipidi en clascificæ inte di sciti d’esportaçion selettivi into percorso secretöio e o revela l’importansa da longhixe da cadeña açilica pe-a selettivitæ de clascificaçion. Pe mezo de unna tecnica de microcoscopia potente e d’avanguardia ciammâ SCLIM, emmo demostrou che o Gas1-GFP scintetizzou da neuva (unna membraña plasmatica importante GPI-AP con unna porçion lipidica de ceramide à cadeña açile assæ longa (C26)) into levou ) E regioin ammuggiæ inte de proteiñe speçifiche de transmembra discrete en assoçiæ pe mezo de ER ES segrete. a membraña ER (figua 1). Pe de ciù, ste doe qualitæ de ben intran selettivamente inte di ERES despægi (figua 2). A longhixe da cadeña açile da ceramide çellolare inta membraña a vëgne reduta da C26 à C18-C16, o gruppo Gas1-GFP o vëgne interrotto inta region ER discreta e Gas1-GFP o vëgne reindirizzou pe lasciâ l’ER co-a proteiña trasmembraña atraverso do mæximo ERES (figua 3 e figua 3). 4).
Sciben che GPI-AP o deuvia un mecanismo proteico speçializzou pe sciortî feua da l’ER, emmo nottou che a seperaçion dependente da ceramide C26 a no se basa in scê interaçioin differensiale de proteiñe che peuan portâ a-a speçializzaçion de l’ERES (figue S4 e S5). A-o conträio, e nòstre descoverte sostëgnan un mecanismo de clascificaçion alternativo guiddou da l’aggruppamento de proteiñe basæ in scî lipidi e da-a conseguente escluxon d’atre carreghe. E nòstre osservaçioin indican che a region ò o gruppo Gas1-GFP assoçiou à un ERES speçifico o l’à mancansa da proteiña Mid2-iRFP secreta da-a trasmembraña, cösa ch’a l’indica che o gruppo GPI-AP dependente da-a ceramide C26 o l’anià ciù façile a seu intrâ inte l’ERES relevante e a-o mæximo tempo o l’escludde sto trasmembraña particolare. 2). Pe contra, a presensa de ceramide C18-C16 inta membraña ER a no pòrta a-o GPI-AP à formâ de regioin ò di gruppi, donca no escluddan ò no sostituiscian e proteiñe secrete da trasmembraña into mæximo ERES (figue 3 e 4). . De conseguensa, proponemmo che a ceramide C26 a guidde a seperaçion e a clascificaçion co-o façilitâ l’aggruppamento de proteiñe ligæ à di ERES speçifichi.
Comm’o l’é poscibile ottegnî sto gruppo dependente da ceramide C26 inte unna speçifica area ER? A tendensa da ceramida de membraña à separâse lateralmente a peu provocâ che a ceramida GPI-AP e C26 forman di lipidi piccin e ordinæ à l’instante inte l’ambiente lipidico ciù irregolare da membraña ER ch’o contëgne di glicerolipidi ciù curti e insatuæ. I gruppi de qualitæ (17, 18). Sti gruppi temporanei piccin peuan vegnî ancon fondi inte di gruppi ciù grendi e stabili dòppo ëse ligæ a-o complesso p24 (34). In coerensa con questo, emmo demostrou che C26 Gas1-GFP o l’à de beseugno d’interagisce co-o complesso p24 pe formâ di ammasci vixibili ciù grendi (figua 3). O complesso p24 o l’é un oligömero eterozigöto compòsto da quattro proteiñe trasmembrañe p24 despæge into levou (35), ch’o fornisce un ligamme moltivalente, ch’o peu portâ à un ligamme incroxou de gruppi piccin de GPI-AP, generando coscì un gruppo stabile ciù grande (34). L’interaçion tra i ectodomini proteichi de GPI-AP a peu contribuî ascì a-a seu aggregaçion, comme demostrou durante o seu traspòrto de Golgi inte çellole epiteliale polarizzæ di mammiferi (36). À tutti i mòddi, quande a ceramide C18-C16 a l’é presente inta membraña ER, quande o complesso p24 o se liga à Gas1-GFP, no se formià di gren ammasci separæ. O mecanismo de sotta o peu depende da-e propietæ fixiche e chimiche speçifiche da ceramida à cadeña açilica longa. I studdi biofixichi de membrañe artifiçiæ demostran che sciben che tanto e ceramide à cadeña açile longa (C24) comme quelle curte (C18-C16) peuan provocâ a seperaçion de fase, solo che e ceramide à cadeña açile longa (C24) peuan promeuve unn’erta curvatua e a curvatua do film pe modellâ torna o film. Pe mezo do referimento reçiproco (17, 37, 38). L’é stæto demostrou che l’elica trasmembraña de TMED2, l’omòlogo uman de Emp24, a l’interagisce selettivamente co-a sfingomieliña basâ in sciâ ceramida C18 inti lòboli citoplasmatichi (39). Pe mezo de scimolaçioin da dinamica molecolare (MD), emmo nottou che tanto e ceramide C18 comme quelle C26 s’ammuggian in scî lòboli citoplasmatichi de l’elica trasmembraña Emp24 e an de preferense che s’assumeggian (figua S6). Va dito che questo o l’indica che l’elica trasmembraña de Emp24 a peu portâ à unna distribuçion ascimetrica di lipidi inta membraña. Sto chì o l’é un resultato reçente basou in scê çellole di mammiferi. De scimolaçioin de MD pæge mostran ascì a presensa de lipidi eterichi (40) . De conseguensa, s’ipòtexi che a ceramide C26 inti doî lòboli de ER26 a segge inricchia localemente. Quande o GPI-AP inti lòboli luminæ o se liga direttamente a-o p24 moltivalente e l’accumulo de ceramide C26 in gio à p24 inti lòboli citoplasmatichi, o peu promeuve l’aggregaçion de proteiñe ch’a l’accompagna e a curvatua de membrañe a vëgne generâ atraverso de die (41), provocando che o GPI-AP o se separe ascì inte die regioin da membraña ER (42). Di rappòrti passæ sostegnivan o meccanismo propòsto (43, 44). O ligamme moltivalente d’oligolectiñe, agenti patògeni ò anticòrpi à di glicosfingolipidi basæ in scê ceramide (GSL) in sciâ membraña do plasma o l’introduxe unna gran aggregaçion de GSL, o l’accresce a seperaçion de fase e o pròvoca a deformaçion e l’internalizzaçion da membraña (44). Iwabuchi.
Inte çellole epiteliale polarizzæ di mammiferi, a conçentraçion da ræ anti-Golgi (TGN) a-o livello da membraña plasmatica apicale a contròlla a seperaçion e a classificaçion de GPI-AP (10, 45). St’aggregaçion a l’é guiddâ da l’oligomerizzaçion GPI-AP (36), ma a peu depende ascì da-a longhixe da cadeña de ceramide ch’attreuviemmo into levou. Sciben che o GPI-AP di mammiferi o l’à unn’ancora à base di lipidi d’etere e a seu struttua chimica a l’é ben ben despægia da-a ceramida à cadeña açilica assæ longa, un studio fæto de reçente o l’à nottou che tutti doî i lipidi an de propietæ e fonçioin fixiche e chimiche che s’assumeggian da-o ponto de vista evolutivo (40). De conseguensa, a parte lipidica etere inte çellole di mammiferi a peu s’assumeggiâ a-a ceramida C26 into levou e o seu ròllo o l’é d’assoçiâse co-a ceramida à cadeña longa inta membraña pe promeuve l’aggregaçion e a classificaçion de GPI-AP. Sciben che sta poscibilitæ a l’à ancon da vegnî verificâ direttamente, de descoverte preçedente sostëgnan che o traspòrto da ceramide à longa cadeña açilica a-o còrpo de Golgi o no l’é fæto da de proteiñe de trasferimento citoplasmatico, ma o depende da-a scintexi d’ancoe GPI comme o levou. De conseguensa, o mecanismo conservatô evolutivo o pâ ëse boin à co-trasportâ selettivamente a ceramida à cadeña açilica assæ longa e o GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) inta mæxima vescicola de traspòrto.
Inti scistemi de çellole epiteliale polarizzæ do levou e di mammiferi, l’aggregaçion e a seperaçion de GPI-AP da atre proteiñe da membraña do plasma se verifican tutte primma d’arrivâ a-a superfiçie da çellola. O Paladino e i atri. (48) an nottou che in sciô TGN de ​​çellole epiteliale polarizzæ di mammiferi, l’aggruppamento de GPI-AP o no l’é neçessäio solo pe-a clascificaçion selettiva di GPI-AP inta membraña plasmatica apicale, ma o regola ascì l’organizzaçion d’aggruppamento di GPI-AP e a seu attivitæ biològica. Superfiçie da çellola. Into levou, sto studio o l’à demostrou che o gruppo GPI-AP dependente da-a ceramide C26 in sce l’ER o peu regolâ l’organizzaçion do gruppo e l’attivitæ fonçionale de GPI-AP in sciâ membraña do plasma (24, 49). In coerensa con sto modello, e çellole GhLag1 en allergiche à di inibitoî de GPI ò à di farmachi che influensan l’intreghitæ da miagia çellolare (28) e a neçescitæ de gruppi fonçionali Gas1-GFP (49) da ceramide de ponta proiettâ inte l’accobiamento de çellole do levou a l’indica G Poscibile conseguense fixològiche de çellole hLag1. Errô GPI-AP. À tutti i mòddi, de atre verifiche se l’organizzaçion fonçionale da superfiçie da çellola a l’é stæta programmâ da l’ER pe mezo de un metodo de classificaçion basou in sciâ longhixe di lipidi saian l’oggetto de nòstre reçerche de l’avvegnî.
I çeppi de Saccharomyces cerevisiae deuviæ inte sto travaggio en elencæ inta tabella S1. I çeppi MMY1583 e MMY1635 de SCLIM pe l’imaging de çellole vivente en stæti costruti into sfondo de W303. Sti çeppi ch’esprimman Sec13-mCherry con un tag de proteiña fluorescente en stæti costruti pe mezo de un metodo basou in sciâ reaçion à cadeña da polimeraxi (PCR) co-o plasmide pFA6a comme modello (23). O çeppo ch’o l’esprimme Mid2-iRFP marcou con unna proteiña fluorescente sotta o contròllo do promotô GAL1 o l’é stæto costruto comme segue. Amplificaçion pe PCR da sequensa iRFP-KanMx da-o vettô pKTiRFP-KAN (regalo de E. O’Shea, plasmide Addgene numero 64687; identificatô de resòrse de reçerca (RRID): Addgene_64687 o l’é stæto introduto into C2 Dòppo che a sequensa do genöma Mid2-iRFP a l’é stæta amplificâ e clonâ into promotô GAL1, a l’é stæta intregâ into scito Not I-Sac I do plasmide d’integraçion pRS306. O plasmide pRGS7 ch’o ne resultava o l’é stæto linearizzou con Pst I pe integrâse into locus URA3.
O gene de fuxon Gas1-GFP o l’é espresso sotta o contròllo do promotô GAL1 into plasmide do çentròmero (CEN), ch’o l’é costruto comme segue. A sequensa Gas1-GFP a l’é stæta amplificâ pe PCR da-o plasmide pRS416-GFP (24) (regalo de L. Popolo) e clonâ into scito Xma I-Xho I do plasmide CEN pBEVY-GL LEU2 (regalo de C). Millero; Plasmide azzonto numero 51225; 51225; RRID: Azzonta_51225). O plasmide ch’o ne resultava o piggiava o nomme de pRGS6. O gene de fuxon Axl2-GFP o l’é espresso ascì sotta o contròllo do promotô GAL1 do vetô LEU2 pBEVY-GL e a seu costruçion a l’é a seguente. A sequensa Axl2-GFP a l’é stæta amplificâ da-o plasmide pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) pe PCR e a l’é stæta clonâ into scito Bam HI-Pst I do vettô LEU2 pBEVY-GL. O plasmide ch’o ne resultava o piggiava o nomme de pRGS12. A sequensa di oligonucleotidi deuviæ inte sto studio a l’é elencâ inta tabella S2.
O çeppo o l’é stæto supplementou con un mezzo 0.2% d’adeniña e 2% de glucòsio [YP-destròsa (YPD)], 2% de raffinosa [YP-raffinosa] ricco de proteiña p (YP) estratto de levou (1% estratto de levou e 2% proteiña ept). (YPR)] ò 2% de galattòsio [YP-galattòsio (YPG)] comme vivagne de carbònio, ò inte un mezzo minimo scintetico (0,15% de base d’azöto de levou e 0,5% de sorfato d’ammonio) pe supplementâ i aminoaçidi e e base appropriæ neçessäi pe-a nutriçion , E contegnuo do 2% de glucòsio scintetico minimo2 ( (mezzo minimo de galattòsio scintetico) comme vivagne de carbònio.
Pe l’imaging in tempo reale, e çellole mutante sec31-1 senscibile a-a temperatua ch’esprimman o costruto sotta o promotô GAL1 en stæte cortivæ inte un mezzo YPR à 24°C pe-a neutte fin a-a fase mid-log. Dòppo l’induçion inte YPG à 24°C pe unn’oa, e çellole en stæte incubæ inte SG à 37°C pe 30 menuti e dapeu trasferie à 24°C pe relasciâse da-o blòcco de secreçion. A concanavaliña A a l’é stæta deuviâ pe fissâ e çellole in sce unna vescicola de veddro e imaginâ da SCLIM. SCLIM a l'é unna combinaçion de microscòpio à fluorescensa inversa Olympus IX-71 e lente à euio con apertua numerica UPlanSApo 100×1,4 (Olympus), scanner confocale à disco rotante à erta speditessa e rappòrto segnâ-rumô erto (Yokogawa Electric e personalizzou), spettrometro confocale (Fòtònica Hamamatsu) o peu fornî un scistema de lente d’ingrandimento con unn’ingrandimento finale de ×266,7 e unna telecamera à dispoxitivo accobbiou à carrega ch’a moltiplica i elettroin (Fòtònica Hamamatsu) (21). L'aquixiçion de l'imagine a l'é fæta da un programma personalizzou (Yokogawa Electric). Pe-e figue 3D emmo deuviou un attuatô piezoelettrico fæto in sce mesua pe vibrâ a lente oggettiva in verticale e emmo arrecuggeito e parte ottiche à distansa de 100 nm inte unna pila. L’imagine da pila Z a ven convertia inte di dæti voxel 3D e a fonçion teòrica de diffuxon di ponti deuviâ pe-o microscòpio confocale à disco rotante a ven deuviâ pe l’elaboraçion da deconvoluçion da-o software Volocity (PerkinElmer). Pe mezo do software Volocity pe limitâ automaticamente o livello pe l'analixi da co-poxiçion, l'é stæto mesuou l'ERES, compreiso a carrega. L’analixi à scanscion de linie a l’é stæta fæta pe mezo do software MetaMorph (dispoxitivi molecolari).
Utilizzâ o programma GraphPad Prism pe determinâ o scignificato statistico. Pe-o test t do Student à doe coe e o test ordinäio d'analixi de variansa à senso unico (ANOVA), e differense tra-i gruppi son tegnue pe avei un effetto scignificativo in sce P <0,05 (*).
Pe-a microcoscopia à fluorescensa de Gas1-GFP, e çellole de fase log en stæte cresciue pe unna neutte inte YPD e recuggeite pe centrifugaçion, lavæ doe vòtte con de soluçion salina tamponâ con fosfato e incubæ in sciâ giassa pe-o manco 15 menuti e dapeu en stæte proçedue sotta o microscòpio comme descrito primma (Check24). Pe l’aquixiçion l’é stæto deuviou o microscòpio Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1,40 à euio PH3 CS) fornio con unn’obiettiva, un filtro L5 (GFP), unna macchina fotografica Hamamatsu e un programma Application Suite X (LAS X). .
I campioin son stæti desnatuæ con un tampon de campion SDS à 65°C pe 10 menuti e dapeu separæ da l'elettroforexi in sce gel de poliacrilamida SDS (PAGE). Pe l'analixi d'immunotrasferimento, 10 μl de campion son stæti carregæ pe corsia. Anticòrpo primmäio: deuviâ l’anti-Gas1 policlonale de coniggi à unna diluiçion de 1:3000, l’anti-Emp24 policlonale de coniggi à unna diluiçion de 1:500 e l’anti-GFP policlonale de coniggi (un regâ de H. Riezman) à unna diluiçion de 1:3000. L’anticòrpo monoclonale anti-Pgk1 de ratto o l’é stæto deuviou à unna diluiçion de 1:5000 (un regâ de J. de la Cruz). Anticòrpo segondäio: immunoglobuliña G (IgG) de crava coniugâ co-a peroscidaxi do ravanello (HRP) deuviâ à unna diluiçion de 1:3000 (Pierce). L’IgG anti-ratto de crava coniugâ à HRP a l’é stæta deuviâ à unna diluiçion de 1:3000 (Pierce). A zöna de respòsta immunitäia a l’é stæta osservâ co-o metodo de chimiluminescensa do reagente SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific).
Comme descrito into (31), l’é stæto fæto un esperimento d’immunopreçipitaçion naturale in sciâ fraçion ER inricchia. In curta, lavâ e çellole do levou con un tampon TNE [tris-HCl 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM e mescciua d’inibitô de proteaxi) à 600 nm (OD600 desenscitico) à 100 òttiche. O l'ea rotto con de perle de veddro e dapeu i detriti de çellole e e perle de veddro en stæti rempossi pe centrifugaçion. Dapeu o sorvenatante o l’é stæto centrifugou à 17.000 g pe 15 menuti à 4°C. O pellet o l’é stæto misso torna in sospenscion inte TNE e a saponiña digitalis a l’é stæta azzonta à unna conçentraçion finale de l’1%. A sospenscion a l’é stæta incubâ pe unn’oa con rotaçion à 4°C e dapeu i componenti che no se soluiscian en stæti rempossi pe centrifugaçion à 13.000 g à 4°C pe 60 menuti. Pe l'immunopreçipitaçion Gas1-GFP, primma preincubâ o campion con de perle d'agarosa veue (ChromoTek) à 4°C pe unn'oa e dapeu incubâ con GFP-Trap_A (ChromoTek) à 4°C pe træ oe. E perle immunopreçipittæ en stæte lavæ çinque vòtte con TNE ch’o contegniva a-o 0.2% de digoscigeniña, eluie con un tampon de campion SDS, separæ in sce SDS-PAGE e analizzæ pe immunotrasferimento.
Comme descrito into (31), a determinaçion do ligamme incroxou a l’é stæta fæta in sciâ fraçion ER inricchia. In curto, a fraçion ER inricchia a l’é stæta incubâ con 0.5 mM de ditiobis (propionato de succinimidilo) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, USA; 20°C, 20 min). A reaçion de reticolaçion a l’é stæta asmortâ con l’azzonta de gliciña (conçentraçion finale de 50 mM, 5 menuti, 20°C).
Comme l’é stæto descrito primma (50), l’é stæto fæto l’analixi MS da ceramide inte di çeppi de tipo sarvægo e GhLag1. À dîla curta, e çellole en stæte cresciue à fase esponençiale (da 3 à 4 unitæ OD600/ml) inte YPD à 30°C e 25×107 çellole en stæte recuggeite. O seu metabolismo o ven asmortou con l’açido tricloroaçetico. Utilizzâ un solvente d’estraçion [etanölo, ægua, etere, piridiña e idròscido d’ammonio à 4,2 N (15:15:5:1:0,018 v/v)] e 1,2 nmol de qualitæ de ceramide C17 standard interna (860517, lipidi polare Avanti). Deuviâ o reagente de monometilamina [metanölo, ægua, n-butanölo e soluçion de metilamina (4:3:1:5 v/v)] pe effettuâ unn’idrolixi alcaliña lieve de l’estratto e dapeu deuviâ o n-butanölo satuou d’ægua pe desallâ. Pe finî, l’estratto o l’é stæto misso torna in sospenscion inte un solvente à modalitæ poxitiva [cloroformo/metanölo/ægua (2:7:1) + 5 mM d’açetato d’ammonio] e iniettou into spettrometro de massa. O monitoraggio à ciù reaçioin (MRM) o l’é stæto fæto pe l’identificaçion e a quantificaçion de molecole de sfingolipidi. O spettròmetro de massa quadrupòlo terçiäio TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) o l’é fornio con unna vivagna de ioin à nanoflusso robòtica Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, New York) pe l’analixi di lipidi. L’energia de collixon a l’é ottimizzâ pe ògni categoria de ceramide. I dæti de MS son stæti ottegnui in modalitæ poxitiva. Pe ògni replicâ biològico, o segnâ lipidico o l’é a mediaña de træ mesuaçioin independente.
Comme l’é stæto descrito into (31), e çellole (800×107) ch’esprimman Gas1-GFP en stæte sottopòste à unn’immunopreçipitaçion naturale. O Gas1-GFP purificou o l’é stæto separou da SDS-PAGE e trasferio à unna membraña de fluoruro de polivinilideno (PVDF). A proteiña a l’é stæta visualizzâ co-a coloraçion de PVDF con l’amido neigro. A banda Gas1-GFP a l’é stæta taggiâ da-o PVDF e lavâ 5 vòtte con do metanölo e unna vòtta con de l’ægua de qualitæ cromotografia liquida-MS (LC-MS). Incubando a striscia de membraña con 500 μl de NaOAc 0,3 M (pH 4,0), tampon e 500 μl de mescciua de nitrito de sòdio 1 M deslenguâ da neuva à 37°C pe træ oe, a fraçion lipidica a ven relasciâ da Gas1-GFP e fosæxiña de cerfaxiña relasciâ (51). Dòppo, a striscia de membraña a l’é stæta lavâ quattro vòtte con de l’ægua de qualitæ LC-MS, asciugâ à temperatua ambiente e conservâ inte unn’atmosfera d’azöto à -80°C fin à l’analixi. Comme contròllo, l'é stæto addeuviou un campion veuo de membraña de PVDF pe ògni esperimento. O lipidico estræto da Gas1-GFP o l’é stæto dapeu analizzou da MS comme descrito (50). À dîla curta, e strisce de PVDF che contegnivan di lipidi GPI en stæte sospeise torna inte 75 μl de solvente de moffa negativo [cloroformo/metanölo (1:2) + 5 mM d’açetato d’ammonio] e an passou l’ionizzaçion à elettrospray (ESI)-analixi MRM/MS de speçie de sfingolipidi (TSQ Vantage). Inte sto caxo, i dæti de MS s’en ottegnui in modalitæ ionica negativa.
Comme l’é stæto dito primma, a porçion lipidica de l’ancoa GPI a l’é stæta separâ da-o GPI-AP marcou con [3H]-inoxitolo (16). I lipidi en stæti separæ pe cromotografia à seu sottî pe mezo de un scistema de solvente (55:45:10 cloroformo-metanölo-0,25% KCl) e vixionæ pe mezo de FLA-7000 (Fujifilm).
E çellole ch’esprimman Gas1-GFP (600×107) en stæte lavæ doe vòtte con un tampon TNE con un tampon TNE e rotte con de perle de veddro e dapeu centrifugæ pe remeuve i detriti de çellole e e perle de veddro. Dapeu o sorvenatante o l’é stæto centrifugou à 17.000 g pe unn’oa à 4°C. O pellet o l’é stæto lavou inte TNE e incubou con 1 U PI-PLC (Invitrogen) inte TNE ch’o contegniva o 0.2% de saponiña digitalis pe unn’oa à 37°C. Dòppo o trattamento con l’enzima, a membraña a l’é stæta remota pe centrifugaçion à 17.000 g à 4°C pe unn’oa. Pe immunopreçipittâ Gas1-GFP, o sorvenatante o l’é stæto incubou con GFP-Trap_A (ChromoTek) à 4°C pe tutta a neutte. O Gas1-GFP purificou separou da SDS-PAGE o l’é stæto colorou co-o bleu brillante de Coomassie. A banda de coloraçion Gas1-GFP a l’é stæta taggiâ da-o grixo ch’o l’intornava l’aquedotto e dapeu, dòppo l’alchilaçion con iodoacetamida e a reduçion con ditiotreitolo, s’é fæto a digestion in gel co-a tripsiña. Estrae e secca di peptidi triptichi e di peptidi con di glicani GPI. O peptide secco o l’é stæto deslenguou inte 20 μl d’ægua. Injettâ unna porçion (8μl) into LC. Unna chinòlla d’ottadeçilsilano (ODS) a l’é stæta deuviâ pe separâ i peptidi inte de condiçioin de gradiente speçifiche. A fase mòbile a l’é o solvente A (0.08% d’açido fòrmico) e o solvente B (0.15% d’açido fòrmico inte l’80% d’açetonitrilo). Un scistema HPLC Accela (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) o l’é stæto deuviou pe eluî a chinòlla co-o solvente A drento de 55 menuti à un tasso de portâ de 50 μl min-1 pe 5 menuti e dapeu a conçentraçion do solvente B a l’é stæta portâ a-o 40%. , Stati Unii). L’eluou o l’é stæto introduto delongo inta vivagna de ioin ESI e i peptidi triptichi e i peptidi con di glicani GPI en stæti analizzæ da LTQ Orbitrap XL (spettròmetro de massa lineare ibrido trappoa-orbitrappo de ioin; Thermo Fisher Scientific). Inte l’impostaçion do MS, a tenscion da vivagna capillare a l’ea stæta fixâ à 4,5 kV e a temperatua do capillare de trasferimento a l’ea stæta mantegnua à 300°C. A tenscion capillare e a tenscion da lente do canno en stæte impostæ in sce 15 V e 50 V rispettivamente. I dæti MS son stæti ottegnui in modalitæ ionica poxitiva (resoluçion de 60.000; preçixon de massa de 10 parte pe mioin) inte un intervallo de massa de 300/m/z rappòrto massa/carrega (m/z) 3000. I dæti MS/MS s’ottëgnan pe mezo da trappoa ionica into primmo dibit LTLQ, O dissoçiaçion induta da-a collixon (CID)].
E scimolaçioin de MD en stæte fæte pe mezo do programma GROMACS (52) e do campo de fòrsa MARTINI 2 (53-55). Dapeu o construttô de membrañe GUI CHARMM (56, 57) o l’é stæto deuviou pe costrue un bilayer ch’o contëgne da dioleoilfosfatidilcoliña (DOPC) e Cer C18 ò DOPC e Cer C26. A topologia e e coordinæ de Cer C26 ne vëgnan da DXCE co-a remoçion de perle extra da-a coa de sfingosiña. Deuviâ o proçesso descrito chì sotta pe equilibrâ o seu doggio e exeguîlo, e dapeu deuviâ e urtime coordinæ do scistema pe construe un scistema ch’o contëgne Emp24. O dominio trasmembrano do levou Emp24 (rescidui da-o 173 a-o 193) o l’é stæto costruto comme unn’elica α pe mezo da struttua molecolare do strumento vixivo MD (VMD) (58). Dapeu, dòppo avei remposso i lipidi che se creuvan uña in sce l’atra, a proteiña a l’é stæta granulâ grossolanamente e inseria into bilayer pe mezo da GUI CHARMM. O scistema finale o contëgne 1202 DOPC e 302 Cer C26 ò 1197 DOPC e 295 Cer C18 e Emp24. Ionizzâ o scistema à unna conçentraçion de 0.150M. Quattro replici independenti en stæti fæti pe doî compoxiçioin à doî seu.
O bilayer lipidico o l’é equilibrou pe mezo do proçesso GUI CHARMM, ch’o compòrta a minimizzaçion e dapeu l’equilibrio de 405.000 pasci, donde i vincoli de poxiçion vëgnan reduti e eliminai pöco à pöco, e o passo de tempo o vëgne aumentou da 0.005 ps à 0.02 ps. Dòppo l’equilibrio, o produxe 6 μs con un passo de tempo de 0.02 ps. Dòppo avei inserio Emp24, deuviæ o mæximo proçesso GUI CHARMM pe redue a-o minimo e equilibrâ o scistema e dapeu exeguîlo pe 8 s inta produçion.
Pe tutti i scistemi, into proçesso d'equilibrio, a prescion a l'é controllâ da-o barostato do Berendsen (59) e into proçesso de produçion, a prescion a l'é controllâ da-o barostato do Parrinello-Rahman (60). Inte tutti i caxi a prescion media a l’é de 1 bar e se deuvia un schema d’accobbio de prescion semi-isòtropa. Into proçesso d’equilibrio e de produçion, se deuvia un termostato (61) con unna recalibraçion de speditessa pe accobbiâ a temperatua de partiçelle de proteiñe, lipidi e solvente rispettivamente. Durante l'intrego fonçionamento, a temperatua de destinaçion a l'é de 310K. L’interaçion sensa ligamme a ven carcolâ co-o generâ unna lista d’accobiamenti pe mezo do schema de Verlet con unna tolleransa de tampon de 0.005. O termine de Coulomb o ven carcolou pe mezo do campo de reaçion e unna distansa de limite de 1,1 nm. O termine de Vander Waals o deuvia un schema de taggio con unna distansa de taggio de 1,1 nm e o schema de taggio de Verlet o vëgne deuviou pe-a deriva potençiale (62).
Pe mezo da VMD, a longhixe d’onda de limite tra e perle de fosfato DOPC ò e perle de ceramide AM1 e a proteiña a l’é de 0.7 nm e se carcola a quantitæ de lipidi ch’interagiscian co-a proteiña. Segondo a formola ch’a ven apreuvo, carcolâ o fattô d’inricchimento-depleçion (DE) comme into (63): fattô DE = (a quantitæ de lipidi totali inta proteiña 0,7) inta proteiña 0,7 (a quantitæ de Cer inti lipidi totali)
O valô reportou o s’ottëgne comme media e e bare d’errô son quattro còpie independente de SE. O scignificato statistico do fattô DE o l'é carcolou da-o test t [(fattô DE-medio-1)/SE]. Carcolâ o valô de P da-a distribuçion à unna coa sola.
O strumento GROMACS o l’é stæto deuviou pe carcolâ a mappa de denscitæ laterale 2D do scistema ch’o contëgne Emp24 drento di urtimi 250 ns da traccia. Pe ottegnî a mappa d’inricchimento/depleçion da ceramide, a mappa de denscitæ de Cer a ven divixa pe-a somma da mappa de Cer e DOPC e dapeu divixa pe-a conçentraçion de Cer into còrpo. Se deuvia a mæxima scâ de mappa de cô.
Pe di mateiæ in azzonta pe sto articolo, consultâ http://www.
Sto chì o l'é un articolo à accesso averto distribuio a-e condiçioin da liçensa d'attribuçion-no commerciâ de Creative Commons, ch'a permette l'uso, a distribuçion e a reproduçion inte quæ se segge mezzo, basta che l'uso finale o no segge pe guägno commerciâ e a premissa a segge che o travaggio originâ o segge corretto. Referensa.
Nòtta: ti domandemmo solo de fornî o teu indirizzo email de mainea che a persoña ch'o ti recommanda a-a pagina a sa che ti veu che a vedde l'email e ch'o no l'é spam. No cattuemmo nisciun indirizzo email.
Sta domanda a ven deuviâ pe verificâ se ti l'é un vixitatô e pe prevegnî l'invio automatico do spam.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero (Ana Maria Perez Logihope -Linero), Waga, Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
L’imaging 3D in tempo reale à erta resoluçion o revela l’importansa da longhixe da cadeña de ceramide pe-a classificaçion de proteiñe inti sciti de produçion selettivi.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero (Ana Maria Perez Logihope -Linero), Waga, Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
L’imaging 3D in tempo reale à erta resoluçion o revela l’importansa da longhixe da cadeña de ceramide pe-a classificaçion de proteiñe inti sciti de produçion selettivi.
©2020 Assoçiaçion americaña pe-o progresso da sciensa. tutti i driti reservai. AAAS o l'é un compagno de HINARI, AGORA, OARE, CÒRO, ORLOGISS, Referimenti incroxæ e CONTATÔ. I progresci da sciensa ISSN 2375-2548.