Diverse teorie in sciâ defeisa de ciante forniscian unn’importante guidda teòrica pe spiegâ i modelli de metabolismo speçializzou inte ciante, ma e seu previxoin ciave an da vegnî verificæ. Chì emmo deuviou l’analixi de spettrometria de massa tandem imparçiale (MS/MS) pe esplorâ scistematicamente o metabòloma di çeppi attenuæ da-o tabacco da-e scingole ciante à de popolaçioin e à de speçie ligæ streitamente e emmo elaborou unna gran quantitæ de teorie de caratteristiche spettrometriche de massa basæ in sce di spettri compòsti inte informaçioin. Quaddro pe verificâ e previxoin ciave de teorie da defeisa ottimale (OD) e do bersalio mòbile (MT). O componente informativo da metabòmica de ciante o l’é coerente co-a teoria OD, ma o contradixe a previxon prinçipâ da teoria MT in sciâ dinamica da metabòmica provocâ da-i erbivoi. Da-a scâ evolutiva micro a-a macro, o segnâ de jasmonato o l’é stæto identificou comme o determinante prinçipâ de l’OD, mentre o segnâ d’etilene o forniva l’accordo fin da respòsta speçifica de l’erbivoro annotâ da-a ræ molecolare MS/MS.
I metaboliti particolæ con de struttue diverse en i parteçipanti prinçipæ à l’adattamento de ciante à l’ambiente, mascime inta defeisa di nemixi (1). A mäveggiosa diverscifficaçion do metabolismo particolare ch’o s’attreuva inte ciante a l’à stimolou de dëxeñe d’anni de reçerche approfondie in scî seu tanti aspeti de fonçioin ecològiche e a l’à formou unna longa lista de teorie in sciâ defeisa de ciante, che son o sviluppo evolutivo e ecològico de interaçioin ciante-insetti. A reçerca empirica a fornisce unna guidda importante (2). À tutti i mòddi, ste teorie da defeisa de ciante no an anæto apreuvo a-o percorso normativo do raxonamento deduttivo ipotetico, donde e previxoin ciave ean a-o mæximo livello d’analixi (3) e vegnivan verificæ sperimentalmente pe fâ anâ avanti o proscimo çiclo de sviluppo teòrico (4). E limitaçioin tecniche restrixan l’arrecuggeita di dæti à de categorie metabòliche speçifiche e escluddan l’analixi approfondia di metaboliti speçializzæ, impedindo coscì di confronti intercategorie che son essençiali pe-o sviluppo teòrico (5). A mancansa de dæti metabolòmichi completi e de unna monæa commun pe confrontâ o flusso de travaggio de processamento do spaçio metabòlico tra diversci gruppi de ciante a l’impedisce a maturitæ scientifica do campo.
I urtimi sviluppi into campo da metabolomica da spettrometria de massa in tandem (MS/MS) peuan caratterizzâ de forma completa i cangi metabòlichi drento e tra e speçie de un çerto clade de scistema e peuan vegnî combinæ con di metodi computaçionali pe carcolâ a sumeggiansa strutturale tra ste mescciue complesse. Conoscensa preçedente da chimica (5). A combinaçion de tecnologie avansæ inte l’analixi e into computing a fornisce un quaddro neçessäio pe-e verifiche à longo raggio de tante previxoin fæte da-e teorie ecològiche e evolutive da diverscitæ metabòlica. O Shannon (6) o l'à introduto a teoria de l'informaçion pe-a primma vòtta into seu articolo fondamentâ do 1948, con mette e base pe l'analixi matematica de l'informaçion, ch'a l'é stæta addeuviâ inte tanti campi despægi da-a seu applicaçion originäia. Inta genòmica, a teoria de l'informaçion a l'é stæta applicâ con successo pe quantificâ l'informaçion conservatoa de sequensa (7). Inta reçerca in sciâ trascrittòmica, a teoria de l’informaçion a l’analizza i cangi complescivi into trascrittòma (8). Inte de reçerche preçedente emmo applicou o quaddro statistico da teoria de l’informaçion a-a metabolomica pe descrive l’experiensa metabòlica do livello di tesciui inte ciante (9). Chì combinemmo o workflow basou in sce MS/MS co-o quaddro statistico da teoria de l’informaçion, caratterizzou da-a diverscitæ metabòlica inta monæa commun, pe confrontâ e previxoin ciave da teoria da defeisa de ciante do metabòloma induto da-i erbivoi.
I quaddri teòrichi da defeisa de ciante pe-o sòlito se comprendan l’un con l’atro e peuan vegnî scompartii inte doe categorie: quelli che çercan de spiegâ a distribuçion di metaboliti speçifichi de ciante basæ in scê fonçioin de defeisa, comme a defeisa ottimale (OD) (10), o bersalio mòbile (MT) (11) ) E l’apparensa (12) de resorse mecaniche de a disponibilitæ a l’influisce in sciâ crescita de ciante e in sce l’accumulo de metaboliti speçializzæ, comme o carbònio: ipòtexi de l’equilibrio di nutrienti (13), ipòtexi do tasso de crescita (14) e l’ipòtexi de l’equilibrio de crescita e differençiaçion (15). I doî insemmi de teorie son à di livelli differenti d'analixi (4). À tutti i mòddi, doe teorie ch’an da fâ co-e fonçioin de defeisa à livello fonçionale dominan a conversaçion in scê defeise constitutive e induçibile de ciante: a teoria OD, ch’a l’ipotizza che e ciante investiscian inte seu cae defeise chimiche solo quande gh’é de beseugno, pe fâ un exempio, quande vëgnan ingerie Quande un animâ d’erba o l’attacca, donca, a poscibilitæ de un fonçion a l’é assegnâ (10); l’ipòtexi MT a propoñe che no ghe segge un asse de cangio direçionale do metabolito, ma o metabolito o cangia à un mòddo casuale, creando coscì a poscibilitæ Ostrue o «bersalio de movimento» metabòlico d’attaccâ i erbivoi. Dita à un atro mòddo, ste doe teorie fan de previxoin oppòste in sciô remodellamento metabòlico ch’o se verifica dòppo l’attacco di erbivoi: a relaçion tra l’accumulo unidireçionale de metaboliti con fonçion de defeisa (OD) e i cangi metabòlichi no diretti (MT) (11).
E ipòtexi OD e MT an da fâ no solo co-i cangi induti into metabòloma, ma ascì e conseguense ecològiche e evolutive de l’accumulo de sti metaboliti, comme i costi adattivi e i benefiçi de sti cangi metabòlichi inte un ambiente ecològico speçifico (16). Sciben che tutte doe e ipòtexi reconoscian a fonçion de defeisa di metaboliti speçializzæ, che peuan ò no peuan ëse caistioxi, a previxon ciave ch’a distingue e ipòtexi OD e MT a l’é inta direçionalitæ di cangi metabòlichi induti. A previxon da teoria da OD a l'à reçevuo l'attençion ciù sperimentale fin oua. Ste preuve comprendan o studio de fonçioin de defeisa diretta ò indiretta de diversci tesciui de compòsti speçifichi inte sære e inte condiçioin naturale, coscì comme i cangi inta fase de sviluppo de ciante (17-19). À tutti i mòddi, fin à oua, apreuvo a-a mancansa de un workflow e de un quaddro statistico pe l’analixi globale completa da diverscitæ metabòlica de tutti i organismi, a previxon da differensa prinçipâ tra e doe teorie (saieiva à dî a direçion di cangi metabòlichi) a l’arresta da verificâ. Chì, fornimmo unn'analixi de sto tipo.
Uña de caratteristiche ciù scignificative di metaboliti speçifichi pe-e ciante a l’é a seu estrema diverscitæ strutturale à tutti i livello, da-e ciante sence, a-e popolaçioin à de speçie che s’assumeggian (20). Tanti cangi quantitativi inti metaboliti speçializzæ peuan vegnî osservæ in sce scâ da popolaçion, mentre de fòrte differense qualitative pe-o sòlito se mantëgnan à livello de speçie (20). De conseguensa, a diverscitæ metabòlica de ciante a l’é l’aspeto prinçipâ da diverscitæ fonçionale, ch’a reflette l’adattabilitæ à diversci nisci, mascime quelli nisci con de poscibilitæ d’invaxon despæge da parte d’insetti particolæ e erbivoi commun (21). Da l’articolo revoluçionäio de Fraenkel (22) in scê raxoin de l’existensa de metaboliti speçifichi pe-e ciante, e interaçioin con diversci insetti en stæte conscideræ comme de prescioin de seleçion importante e se pensa che ste interaçioin aggian modello e ciante durante l’evoluçion. Percorso metabòlico (23). E differense interspeçie inta diverscitæ di metaboliti speçializzæ peuan ascì riflette l’equilibrio fisiològico assoçiou a-a defeisa constitutiva e induçibile de ciante contra e strategie erbivore, dæto che e doe speçie tante vòtte en correlæ negativamente l’uña con l’atra (24). Sciben che peu ëse d’avvantaggio mantegnî delongo unna boña defeisa, i cangi metabòlichi assoçiæ a-a defeisa à tempo forniscian di benefiçi ciæi into permette a-e ciante d’allocâ de resorse de prexo à di atri investimenti fisiològichi (19, 24) e de schivâ a neçescitæ de scimbioxi. Danno collaterale (25). Pe de ciù, ste reorganizzaçioin de metaboliti speçializzæ provocæ da di insetti erbivoi peuan portâ à unna distribuçion destruttiva inta popolaçion (26) e peuan riflette de lettue dirette de cangi naturali sostansiali into segnâ de l’açido jasmònico (JA), che peuan vegnî mantegnui inta popolaçion. I segnæ JA erti e basci en di compromisci tra a defeisa contra i erbivoi e a competiçion con de speçie speçifiche (27). Pe de ciù, i percorsci bioscintetichi de metaboliti speçializzæ patian unna perdia e unna trasformaçion spedia durante l’evoluçion, co-o resultato de unna distribuçion metabòlica irregolâ tra de speçie ligæ streitamente (28). Sti polimorfismi peuan vegnî stabilii a-a spedia in respòsta a-i cangiamenti di modelli d’erbivoi (29), cösa ch’a veu dî che a fluttuaçion de communitæ d’erbivoi a l’é un fattô ciave ch’o guidda l’eterogeneitæ metabòlica.
Chì emmo resòlto into dettaggio i problemi che vëgnan apreuvo. (I) Comm’o l’insetto erbivoro o reconfigura o metabòloma de ciante? (Ii) Quæ son i componenti prinçipæ d’informaçioin da plastiçitæ metabòlica che peuan vegnî quantificæ pe verificâ e previxoin da teoria da defeisa à longo raggio? (Iii) Se l’é neçessäio programmâ torna o metabòloma de ciante à unna mainea unica pe l’attaccante, se l’é coscì, che ròllo o zeuga l’ormon de ciante pe adattâ unna respòsta metabòlica speçifica e che metaboliti contribuiscian a-a speçificitæ da defeisa da speçie? (Iv) Dæto che e previxoin fæte da tante teorie de defeisa peuan vegnî esteise à tutti i livello di tesciui biològichi, emmo domandou quante coerente a l’é a respòsta metabòlica provocâ da-o confronto interno a-o confronto interspeçie? Pe sta finalitæ emmo studiou scistematicamente o metabòlöma de feuggie da nicotiña do tabacco, ch’a l’é unna cianta modello ecològica con un ricco metabolismo speçializzou, e a l’é efficaçe contra e larve de doî erbivoi nativi, i lepidòtti datura (Ms) (Ascimi aggrescivi, mangiæ pe-o ciù) “genus”, co-e ciante òspite de Solanaceae e di atri òspiti d’atri generi e famigge Alimento de ciante. Noemme emmo analizzou o spettro da metabolòmica MS/MS e emmo estræto di descrittoî statistichi da teoria de l'informaçion pe confrontâ e teorie OD e MT. Creâ de mappe de speçificitæ pe revelâ l’identitæ di metaboliti ciave. L’analixi a l’é stæta esteisa a-a popolaçion nativa de N. nasi e a-e speçie de tabacco streitamente ligæ pe analizzâ ancon de ciù a covariansa tra a segnalaçion ormonale de ciante e l’induçion de OD.
Pe cattuâ unna mappa complesciva in sciâ plastiçitæ e a struttua do metabòloma de feuggie do tabacco erbivoro, emmo deuviou un workflow d’analixi e carcolo sviluppou in preçedensa pe arrecheugge e deconvolue de forma completa di spettri MS/MS independenti de dæti à erta resoluçion da-i estratti de ciante ( 9 ). Sto metodo indifferensiou (dito MS/MS) o peu costrue di spettri compòsti no redondanti, che dapeu peuan vegnî deuviæ pe tutte e analixi à livello de compòsti descrite chì. Sti metaboliti de ciante deconvolui en de varie qualitæ, e conscistan da çentanæa à miggiæa de metaboliti (500-1000-s/MS/MS pöcassæ chì). Chì piggiemmo in conscideraçion a plastiçitæ metabòlica into quaddro da teoria de l’informaçion e quantifichemmo a diverscitæ e a profescionalitæ do metabòloma in sciâ base de l’entropia de Shannon da distribuçion da frequensa metabòlica. Pe mezo da formola implementâ in passou (8), emmo carcolou un insemme d’indicatoî che peuan vegnî deuviæ pe quantificâ a diverscitæ do metabòloma (indicatô Hj), a speçializzaçion do profî metabòlico (indicatô δj) e a speçificitæ metabòlica de un metabolito sencio (indicatô Si) . Pe de ciù, emmo applicou l’indiçe de plastiçitæ à distansa relativa (RDPI) pe quantificâ l’induçibilitæ do metabòloma di erbivoi (figua 1A) (30). Inte sto quaddro statistico, trattemmo o spettro MS/MS comme unitæ d’informaçioin de base e processemmo l’abbondansa relativa de MS/MS inte unna mappa de distribuçion de frequensa e dapeu deuviemmo l’entropia de Shannon pe astimmâ a diverscitæ do metabòloma da quella. A speçializzaçion do metabòloma a ven mesuâ da-a speçificitæ media de un spettro MS/MS sencio. De conseguensa, l’aumento de l’abbondansa de çerte classe de MS/MS dòppo l’induçion di erbivori o se trasforma inte l’induçibilitæ spettrale, RDPI e speçializzaçion, saieiva à dî l’aumento de l’indiçe δj, perché se produxe di metaboliti ciù speçializzæ e se produxe un erto indiçe Si. L'abbassamento de l'indiçe de diverscitæ Hj o reflette che ò o numero de MS/MS generæ o l'é reduto ò che a distribuçion da frequensa do profî a cangia inte unna direçion meno uniforme, reduxendo tanto a seu inçertessa complesciva. Pe mezo do carcolo de l'indiçe Si, se peu mette in luxe quæ MS/MS son induti da çerti erbivoi, a-o conträio, quæ MS/MS no respondan à l'induçion, ch'o l'é un indicatô ciave pe distingue a previxon MT e OD.
(A) I descrittoî statistichi deuviæ pe l’induçibilitæ di dæti MS/MS erbivori (da H1 à Hx), a diverscitæ (indiçe Hj), a speçializzaçion (indiçe δj) e a speçificitæ di metaboliti (indiçe Si). Un aumento do graddo de speçializzaçion (δj) o l’indica che, in media, se produià ciù metaboliti speçifichi erbivori, mentre unna diminuçion da diverscitæ (Hj) a l’indica unna diminuçion da produçion de metaboliti ò unna distribuçion despægia di metaboliti inta mappa de distribuçion. O valô de Si o l’astimma se o metabolito o l’é speçifico pe unna çerta condiçion (chì, erbivoro) ò se o se mantëgne a-o conträio a-o mæximo livello. (B) Diagramma conçettuâ da previxon da teoria da defeisa deuviando l'asse da teoria de l'informaçion. A teoria OD a prevedde che l’attacco di erbivori o l’aumentià i metaboliti de defeisa, e donca o l’aumentià δj. A-o mæximo tempo, Hj o se diminuisce perché o profî o l’é reorganizzou verso l’inçertessa reduta de l’informaçion metabòlica. A teoria MT a prevedde che l’attacco di erbivoi o pròvochià di cangi no direçionali into metabòloma, aumentando coscì Hj comme indicatô de unn’inçertessa d’informaçioin metabòliche aumentâ e provocando unna distribuçion casuale de Si. An propòsto ascì un modello mesccio, o megio MT, donde çerti metaboliti con di valoî de defeisa ciù erti saian particolarmente aumentæ (valô de Si erto), tanto che di atri mostran de respòste casuale (valô de Si ciù basso).
Pe mezo di descrittoî da teoria de l’informaçion, interpretemmo a teoria da OD pe prevedde che i cangi de metabòliti speçiali induti da l’erbivoi inte un stato constitutivo no induto portian à (i) un aumento da speçificitæ metabòlica (indiçe Si) ch’o guidda a speçificitæ metabònòmica (indiçe δj) L’aumento de) çerti gruppi de metabòliti speçiali con un valô de defeisa ciù erto indiçe) dovuo a-o cangio da distribuçion da frequensa metabòlica à unna distribuçion ciù grande do còrpo da leptina. A-o livello de un metabolito sencio se prevedde unna distribuçion ordinâ de Si, donde o metabolito o l’aumentià o valô de Si in base a-o seu valô de defeisa (figua 1B). In sce sta linia, spiegemmo a teoria MT pe prevedde che l’eccitaçion a portià à (i) di cangi no direçionali inti metaboliti che se traduxan inte unna diminuçion de l’indiçe δj e (ii) un aumento de l’indiçe Hj dovuo à un aumento de l’inçertessa metabòlica. Ò o caxo, ch'o peu ëse quantificou da l'entropia de Shannon sotta forma de diverscitæ generalizzâ. Pe quello ch’o l’à da fâ co-a compoxiçion metabòlica, a teoria MT a prevedde a distribuçion casuale do Si. Tegnuo in conscideraçion che çerti metaboliti s’attreuvan inte de condiçioin speçifiche inte de condiçioin speçifiche, e de atre condiçioin no son inte de condiçioin speçifiche, e o seu valô de defeisa o depende da l’ambiente, emmo propòsto ascì un modello de defeisa mesccio, donde δj e Hj en distribuii inte doî longo Si Aumenta inte tutte e direçioin, tanto che çerti atri gruppi de metaboliti particolæ aumentan un valô de defeisa erto, che an Si, distribuçion (figua 1B).
Pe verificâ a previxon da teoria da defeisa definia torna in sce l’asse do descrittô da teoria de l’informaçion, emmo cresciuo de larve erbivore esperte (Ms) ò generaliste (Sl) in scê feugge de Nepenthes pallens (figua 2A). Pe mezo de l’analixi MS/MS, emmo repiggiou 599 spettri MS/MS no redondanti (file de dæti S1) da di estratti de metanölo de tesciuo de feugge arrecuggeiti dòppo l’alimentaçion di ombrighi. O deuvio di indiçi RDPI, Hj e δj pe visualizzâ a reconfiguraçion do contegnuo d'informaçioin inti file de configuraçion MS/MS o mostra di modelli interessanti (figua 2B). A tendensa complesciva a l’é che, comme descrito da-o descrittô d’informaçioin, tanto che i ombrighi van avanti à mangiâ de feugge, o graddo de tutta a reorganizzaçion metabòlica o l’aumenta into tempo: 72 oe dòppo che l’erbivoro o mangia, o RDPI o l’aumenta de forma scignificativa. In confronto a-o contròllo no dannezzou, Hj o l'é stæto scignificativamente reduto, ch'o l'é dovuo à l'aumento do graddo de speçializzaçion do profî metabòlico, ch'o l'é stæto quantificou da l'indiçe δj. Sta tendensa apparente a l’é coerente co-e previxoin da teoria OD, ma a no l’é coerente co-e previxoin prinçipæ da teoria MT, ch’a pensa che i cangi casuali (no direçionali) inti livelli de metaboliti vëgnan addeuviæ comme camouflage de defeisa (figua 1B). Sciben che o contegnuo de l’eliçitô de secreçion orale (OS) e o comportamento d’alimentaçion de sti doî erbivoi en despægi, o seu alimentaçion diretta o l’à provocou di cangi pægi inte direçioin de Hj e δj inti periodi de recuggeita de 24 oe e 72 oe. L'unica differensa a l'é avvegnua a-e 72 oe de RDPI. In confronto à quello provocou da l’alimentaçion de Ms, o metabolismo complescivo induto da l’alimentaçion con Sl o l’ea ciù erto.
(A) Progettaçion sperimentale: i erbivoi pòrchi commun (S1) ò esperti (Ms) vëgnan alimentæ con de feugge desalinæ de ciante da vasca, mentre pe l’erbivoia scimolâ, l’OS de Ms (W + OSM) o ven deuviou pe manezzâ a pontuaçion de poxiçioin standardizzæ de feugge ferie. Larve S1 (W + OSSl) ò d’ægua (W + W). O contròllo (C) o l’é unna feuggia no dannezzâ. (B) Indiçe d’induçibilitæ (RDPI in confronto a-o grafico de contròllo), diverscitæ (indiçe Hj) e speçializzaçion (indiçe δj) carcolou pe-a mappa di metabòliti particolæ (599 MS/MS; file de dæti S1). I asterichi indican de differense scignificative tra l'alimentaçion diretta di erbivori e o gruppo contròllo (test t do Student co-o test t in cobbia, *P<0,05 e ***P<0,001). ns, no l'é importante. (C) Indiçe de resoluçion do tempo do spettro prinçipâ (scatoa bleu, aminoaçido, açido organico e succao; file di dæti S2) e do metabòlito speçiale (scatoa rossa 443 MS/MS; file di dæti S1) dòppo o trattamento scimolou d’erbivoi. A banda de cô a fa referensa à l’intervallo de confiansa do 95%. L'asterisco o l'indica a differensa scignificativa tra-o trattamento e o contròllo [analixi quaddratica de variansa (ANOVA), e apreuvo a differensa onestamente scignificativa do Tukey (HSD) pe-i confronti multipli post hoc, *P<0,05, **P<0,01 e *** P <0,001]. (D) Speçializzaçion de grafichi de diffuxon e profî de metaboliti particolæ (campioin repetui con di trattamenti differenti).
Pe esplorâ se a remodellaçion induta da l’erbivoro a-o livello do metabòloma a se reflette inti cangi into livello di metaboliti scingoli, s’emmo conçentræ pe-a primma vòtta in scî metaboliti studiæ in preçedensa inte feugge de Nepenthes pallens con unna rexistensa erbivora demostrâ. E amide fenòliche en di coniugæ idròsciçinnamamide-poliamiña che s’ammuggian durante o proçesso erbivoro di insetti e en conosciui pe redue a prestaçion di insetti (32). Noemme emmo çercou i precursoî do MS/MS correspondente e emmo tracciou e seu curve cinetiche cumulative (figua S1). No s’accapisce che i derivæ do fenolo che no piggian parte direttamente a-a defeisa contra i erbivoi, comme l’açido clorogenico (CGA) e a rutiña, seggian sottoregolæ dòppo l’erbivoio. A-o conträio, i erbivoi peuan rende i amidi de fenòlo assæ potenti. L’alimentaçion continua di doî erbivoi a l’à portou à squæxi o mæximo spettro d’eccitaçion de fenolamidi e sto modello o l’ea particolarmente evidente pe-a scintexi de novo de fenolamidi. O mæximo fenòmeno o saià osservou quande s’esplora o percorso di glicòscidi de diterpeni 17-idròscigeranilo nonanediolo (17-HGL-DTG), ch’o produxe unna gran quantitæ de diterpeni açiclichi con de fonçioin antierbivore efficaçe (33), di quæ a Ms.
O poscibile desvantaggio di esperimenti d’alimentaçion diretta di erbivori o l’é a differensa into tasso de consummo de feugge e into tempo d’alimentaçion di erbivoi, cösa ch’a rende diffiçile eliminâ i effetti speçifichi di erbivori provocæ da-e ferie e da-i erbivoi. Pe resòlve megio a speçificitæ da speçie erbivora da respòsta metabòlica de feugge induta, emmo scimolou l’alimentaçion de larve Ms e Sl applicando de botto l’OS recuggeito da neuva (OSM e OSS1) a-a pontua standard W de poxiçioin coerente de feugge. Sta proçedua a piggia o nomme de trattamento W + OS e a standardizza l’induçion co-o temporizzâ con esattessa l’incomenso da respòsta provocâ da l’erbivoro sensa provocâ di effetti confuxi de differense into tasso ò inta quantitæ de perdia de tesciui (figua 2A) (34). Pe mezo do pipeline d'analixi e de carcolo MS/MS, emmo repiggiou 443 spettri MS/MS (file de dæti S1), che se creuvan co-i spettri assemblæ in passou da di esperimenti d'alimentaçion diretta. L’analixi da teoria de l’informaçion de sto insemme de dæti MS/MS a l’à mostrou che a reprogrammaçion di metabòlimi speçializzæ inte feugge pe mezo da scimolaçion di erbivoi a l’à mostrou di induçioin speçifichi pe-o OS (figua 2C). Ciù into dettaggio, in confronto a-o trattamento con OSS1, OSM o l’à provocou un megioamento da speçializzaçion do metabòloma à 4 oe. Va dito che in confronto à l’insemme de dæti sperimentali d’alimentaçion diretta di erbivori, a cinetica metabòlica visualizzâ into spaçio bidimenscionale pe mezo de Hj e δj comme coordinæ e a direçionalitæ da speçializzaçion do metabòloma in respòsta a-o trattamento scimolou d’erbivori into tempo a l’aumenta coerentemente (figua 2D). A-o mæximo tempo, emmo quantificou o contegnuo d’aminoaçidi, açidi organichi e succai (file de dæti S2) pe indagâ se st’aumento mirou de l’experiensa do metabòloma o l’é dovuo a-a reconfiguraçion do metabolismo do carbònio çentrale in respòsta à di erbivoi scimolæ (figua S2). Pe spiegâ megio sto modello, emmo monitorou ancon de ciù a cinetica de l’accumulaçion metabòlica di percorsci fenolamide e 17-HGL-DTG tratæ in passou. L’induçion speçifica de l’OS di erbivoi a se trasforma inte un modello de redispoxiçion differensiale drento do metabolismo de fenolamide (figua S3). I amidi fenòlichi che contëgnan de porçioin de cumariña e caffeoilo en induti de preferensa da OSS1, mentre i OSM provocan unna speçifica induçion de coniugæ de ferulilo. Pe-o percorso 17-HGL-DTG l’é stæto nottou l’induçion differensiale de OS pe mezo de produti de malonilaçion e dimalonilaçion à valle (figua S3).
Pe avanti, emmo studiou a plastiçitæ do trascrittòma induta da l’OS pe mezo de l’insemme de dæti de microarray into corso do tempo, ch’o scimola l’utilizzaçion de OSM pe trattâ e feugge de feuggie de ciante à rosetta inti erbivoi. A cinetica do campionamento a se creuve in sostansa co-a cinetica addeuviâ inte sto studio de metabolomica (35). In confronto a-a reconfiguraçion do metabòloma donde a plastiçitæ metabòlica a l’é particolarmente aumentâ into tempo, s’osserva di esploxoin de trasmiscion transientale inte feugge indute da Ms, donde l’induçibilitæ do trascrittòma (RDPI) e a speçializzaçion (δj) son à 1 Gh’é stæto un aumento scignificativo de oe, e a diverscitæ (Hj) a l’é stæta reduta scignificativamente da-o ponto de tempo de BMP1. de speçializzaçion do trascrittòma (figua S4). E famigge de geni metabòlichi (comme P450, a glicosiltrasferaxi e l’açiltrasferaxi BAHD) piggian parte a-o proçesso d’assemblaggio de metaboliti speçiali da unitæ strutturale derivæ da-o metabolismo primmäio, segondo o primmo modello d’erta speçializzaçion stæto mensunou chì de d’ato. Comme studio de caxo, l’é stæto analizzou o percorso da fenilalaniña. L’analixi a l’à confermou che i geni do nucleo into metabolismo da fenolamida en assæ induti da-o OS inti erbivoi in confronto a-e ciante no attræte e en allinæ streitamente inti seu modelli d’esprescion. O fattô de trasmiscion MYB8 e i geni strutturali PAL1, PAL2, C4H e 4CL à montâ de sto percorso an mostrou un comenso tempoio da trasmiscion. E açiltrasferaxi che zeugan un ròllo inte l’assemblaggio finale da fenolamida, comme AT1, DH29 e CV86, mostran un modello d’opregolaçion prolongou (figua S4). E osservaçioin stæte mensunæ de d’ato indican che l’iniçio tempoio da speçializzaçion do trascrittòma e o megioamento succescivo da speçializzaçion da metabolomica en unna modalitæ accobbiâ, ch’a peu ëse dovua a-o scistema de regolaçion scincrònico ch’o l’iniçia unna fòrte respòsta de defeisa.
A reconfiguraçion inta segnalaçion ormonale de ciante a fonçioña comme un seu de regolaçion ch’o l’integra e informaçioin erbivore pe programmâ torna a fisiologia de ciante. Dòppo a scimolaçion di erbivoi, emmo mesuou a dinamica cumulativa de categorie ciave d’ormoin de ciante e emmo visualizzou a coesprescion temporale tra de liatre [coeffiçente de correlaçion de Pearson (PCC)> 0.4] (figua 3A). Comme se peu prevedde, i ormoin vegetali ligæ a-a bioscintexi en ligæ drento da ræ de coesprescion di ormoin vegetali. Pe de ciù, a speçificitæ metabòlica (indiçe Si) a ven mappâ in sce sta ræ pe mette in luxe i ormoin de ciante induti da diversci trattamenti. Vegnan disegnæ doe aree prinçipæ de respòsta speçifica di erbivori: uña a l’é into gruppo JA, donde JA (a seu forma biologicamente attiva JA-Ile) e di atri derivæ de JA mostran o pontuaçion Si ciù erto; l’atro o l’é l’etilene (ET). A gibberelliña a l’à mostrou solo che un aumento moderou da speçificitæ di erbivoi, mentre di atri ormoin vegetali, comme a citochiniña, l’auxiña e l’açido absciscico, aivan unna bassa speçificitæ d’induçion pe-i erbivoi. In confronto à l’utilizzaçion de W + W da solo, l’amplificaçion do valô de çimma di derivæ de JA pe mezo de l’applicaçion OS (W + OS) a peu ëse trasformâ in sostansa inte un fòrte indicatô speçifico de JA. À un mòddo inaspëtou, se sa che OSM e OSS1 con un contegnuo d’eliçitô differente pròvocan unn’accumulaçion pægia de JA e JA-Ile. À differensa de OSS1, OSM o l’é induto de mainea speçifica e fortemente da-i OSM, mentre OSS1 o no l’amplifica a respòsta de ferie basale (figua 3B).
(A) Analixi da ræ de coesprescion basâ in sciô carcolo PCC da scimolaçion cinetica d’accumulo d’ormoin vegetale induta da-i erbivoi. O nòdo o representa un solo ormon vegetale e a dimenscion do nòdo a representa l’indiçe Si speçifico de l’ormon vegetale tra i trattamenti. (B) Accumulo de JA, JA-Ile e ET inte feugge provocou da diversci trattamenti indicæ da diversci coî: abrico, W + OSM; bleu, W + OSSl; negro, W + W; grixo, C (controllo) . I asterisci indican de differense scignificative tra trattamento e contròllo (ANOVA à doî sensci e apreuvo un confronto multiplo post hoc de Tukey HSD, *** P <0,001). Analixi da teoria de l'informaçion de (C)697 MS/MS (file de dæti S1) inta bioscintexi de JA e spettro de perçeçion compromisso (irAOC e irCOI1) e (D)585 MS/MS (file de dæti S1) inte ETR1 con segnâ ET compromisso Doî trattamenti de contròllo de linie erbivori scimolæ e cian de veicolo EV descadenæ. I asterisci indican de differense scignificative tra-o trattamento W+OS e o contròllo no dannezzou (ANOVA à doî sensci e apreuvo un confronto multiplo post hoc de Tukey HSD, *P<0,05, **P<0,01 e ***P<0,001). (E) Grafichi despersci d'oppoxiçion despersci a-a speçializzaçion. I coî representan diversci çeppi geneticamente modificæ; i scimboli rappresentan di despægi metodi de trattamento: triangolo, W + OSS1; rettangolo, W + OSM; çercio C
Pe avanti, deuviemmo un çeppo geneticamente modificou de Nepente attenuæ (irCOI1 e sETR1) inti pasci ciave da bioscintexi de JA e ET (irAOC e irACO) e da perçeçion (irCOI1 e sETR1) pe analizzâ o metabolismo de sti doî ormoin de ciante in sciô contributo a-a reprogrammaçion di erbivoi. In coerensa con di esperimenti preçedenti, emmo confermou l’induçion de OS erbivoro inte ciante portatoe veue (EV) (figua 3, da C à D) e a diminuçion complesciva de l’indiçe Hj provocou da OSM, mentre l’indiçe δj o l’é aumentou. A respòsta a l'é ciù marcâ che a respòsta provocâ da OSS1. Un grafico à doe linie ch’o deuvia Hj e δj comme coordinæ o mostra a deregolaçion speçifica (figua 3E). A tendensa ciù òvvia a l’é che inti çeppi sensa segnâ JA, a diverscitæ do metabòloma e i cangi de speçializzaçion provocæ da-i erbivoi vëgnan eliminæ squæxi do tutto (figua 3C). Pe contra, a perçeçion ET mutta inte ciante sETR1, sciben che l’effetto complescivo in scî cangi do metabolismo erbivoro o l’é ben ben ciù basso che quello da segnalaçion JA, a l’ammerma a differensa inti indiçi Hj e δj tra e eçitaçioin OSM e OSS1 (figua 3D e figua S5). . Questo o l’indica che, in azzonta a-a fonçion prinçipâ da trasduçion do segnâ JA, a trasduçion do segnâ ET a serve ascì comme fine-tuning da respòsta metabòlica speçifica da speçie di erbivoi. In coerensa con sta fonçion d’accordo fin, no gh’é stæto de cangi inte l’induçibilitæ complesciva do metabòloma inte ciante sETR1. D’atro canto, in confronto a-e ciante sETR1, e ciante irACO an induto de ampiesse complescive de cangi metabòlichi provocæ da-i erbivoi, ma an mostrou di pontezzi Hj e δj scignificativamente despægi tra e sfidde OSM e OSS1 (figua S5).
Pe identificâ di metaboliti speçializzæ ch’an di contributi importanti a-a respòsta speçifica da speçie di erbivoi e perfeçionâ a seu produçion pe mezo di segnæ ET, emmo deuviou o metodo strutturale MS/MS sviluppou in preçedensa. Sto metodo o se basa in sciô metodo de bi-clustering pe dedue torna a famiggia metabòlica da-i frammenti MS/MS [produto à ponti normalizzou (NDP)] e in sciô pontuaçion de someggiansa basou in sciâ perdia neutrale (NL). L’insemme de dæti MS/MS costruto pe mezo de l’analixi de linie trasgeniche ET o l’à produto 585 MS/MS (file de dæti S1), ch’en stæti resòlti con aggruppâli inte sette mòdoli prinçipæ MS/MS (M) (figua 4A). Çertidun de sti mòdoli en imballæ spessamente con di metaboliti particolæ caratterizzæ primma: pe fâ un exempio, M1, M2, M3, M4 e M7 en ricchi inte diversci derivæ de fenòli (M1), glicòscidi flavonòidi (M2), succai açili (M3 e M4) e 17-HGL-DTG (M7). Pe de ciù, vëgne carcolou l’informaçion speçifica metabòlica (indiçe Si) de un metabolito sencio inte tutti i mòdoli e a seu distribuçion de Si a peu vegnî vista intuitivamente. À dîla curta, i spettri MS/MS che mostran unn’erta speçificitæ d’erbivoi e de genotipo en caratterizzæ da di erti valoî de Si e e statistiche de curtoxi indican a distribuçion do pelliccio into canto da coa drita. Unna de ste distribuçioin de collòide magre a l’é stæta nottâ inte M1, donde l’amida de fenòlo a l’à mostrou a fraçion de Si ciù erta (figua 4B). O 17-HGL-DTG induçibile erbivoro mensunou in passou inte M7 o l’à mostrou un pontuaçion Si moderou, ch’o l’indica un graddo moderou de regolaçion differençiale tra i doî tipi de OS. Pe contra, a ciù parte di metaboliti speçializzæ produti constitutivamente, comme a rutiña, o CGA e i succaî açili, s’attreuvan tra i pontezzi Si ciù basci. Pe esplorâ megio a complescitæ strutturale e a distribuçion de Si tra di metaboliti particolæ, l’é stæto costruto unna ræ molecolare pe ògni mòdolo (figua 4B). Unna previxon importante da teoria OD (ressummia inta figua 1B) a l’é che a reorganizzaçion de metaboliti speçiali dòppo l’erbivoia a dovieiva portâ à di cangi à senso unico inti metaboliti con un erto valô de defeisa, mascime aumentando a seu speçificitæ (a-o conträio da distribuçion casuale) Modo metabolito de defeisa previsto da-a teoria MT. A ciù parte di derivæ de fenolo ammuggiæ inte M1 en fonçionalmente ligæ a-a diminuçion da prestaçion di insetti (32). Quande s’é confrontou i valoî de Si inti metaboliti M1 tra e feugge indute e e feugge constituente de ciante de contròllo EV à 24 oe, s’é osservou che a speçificitæ metabòlica de tanti metaboliti dòppo i insetti erbivoi a l’à unna tendensa scignificativa à l’aumento (figua 4C). L’aumento speçifico do valô de Si o l’é stæto nottou solo che inti fenolamidi defenscivi, ma nisciun aumento do valô de Si o l’é stæto nottou inte di atri fenöli e metaboliti desconosciui che coexistan inte sto mòdolo. Sto chì o l'é un modello speçializzou, ch'o l'é in relaçion a-a teoria do OD. E previxoin prinçipæ di cangi metabòlichi provocæ da-i erbivoi en coerente. Pe verificâ se sta particolaritæ do spettro de fenolamide a l’é stæta induta da ET speçifico pe OS, emmo tracciou l’indiçe Si do metabolito e emmo provocou un valô d’esprescion differensiale tra OSM e OSS1 inti genotipi EV e sETR1 (figua 4D). Inte sETR1, a differensa induta da-a fenamide tra OSM e OSS1 a l’é stæta ben ben reduta. O metodo de bi-clustering o l’é stæto applicou ascì a-i dæti MS/MS arrecuggeiti inte di çeppi con JA mancante pe dedue i mòdoli prinçipæ de MS/MS ligæ a-a speçializzaçion metabòlica regolâ da JA (figua S6).
(A) I exiti d’aggruppamento de 585 MS/MS basæ in sce un frammento scompartio (sommeggiansa NDP) e unna perdia neutrale scompartia (sommeggiansa NL) fan de mòddo che o mòdolo (M) o segge coerente co-a famiggia compòsta conosciua ò da unna compoxiçion de metabolito desconosciua ò pöco metabolizzâ. Da-a rente à ògni mòdolo vëgne mostrou a distribuçion speçifica do metabolito (MS/MS) (Si). (B) Rete molecolare modulare: i nòdi representan MS/MS e i bordi, i pontezzi MS/MS NDP (rosso) e NL (bleu) (cut-off,> 0,6). L’indiçe de speçificitæ do metabolito graduou (Si) o l’é colorou in sciâ base do mòdolo (à manciña) e mappou a-a ræ molecolare (à drita). (C) O mòdolo M1 da cianta EV into stato constitutivo (controllo) e induto (erbivoro scimolou) à 24 oe: diagramma de ræ molecolare (o valô de Si o l’é a dimenscion do nòdo, a fenolamida defensciva a l’é evidençiâ in bleu). (D) O diagramma da ræ molecolare M1 da linia de spettro sETR1 con unna perçeçion EV e ET reduta: o compòsto fenòlico rappresentou da-o nòdo do çercio verde e a differensa scignificativa (valô P) tra i trattamenti W + OSM e W + OSS1 comme dimenscion do nòdo. CP, N-caffeoil-tirosiña; CS, N-caffeoilo-spermidiña; FP, açido N-ferulico ester-açido urico; FS, N-ferulilo-spermidiña; CoP, N’, N “-cumarolil-tirosiña; DCS, N’, N”-dicaffeoil-spermidiña; CFS, N’, N”-caffeoilo, feruloilo-spermidiña; Liçio barbaro into figgio de bacca de lopo; Nick. O-AS, succao O-açilo.
An esteiso ancon l’analixi da un scingolo genotipo de Nepenthes attenuou à de popolaçioin naturale, donde di fòrti cangi intraspeçifichi inti livello de JA erbivoi e inti livello de metaboliti speçifichi en stæti descriti in preçedensa inte popolaçioin naturale (26). Deuviâ sto insemme de dæti pe creuve 43 germoplasmi. Sti germoplasmi en formæ da 123 speçie de ciante de N. pallens. Ste ciante en stæte piggiæ da-e semense arrecuggeite inte diversci habitat nativi inte l’Utah, o Nevada, l’Arizona e a Califòrnia (figua S7), emmo carcolou a diverscitæ do metabòloma (ciammâ chì livello de popolaçion) diverscitæ β) e a speçializzaçion provocâ da l’OSM. In coerensa co-i studdi preçedenti, emmo osservou unna larga gamma de cangi metabòlichi longo i assi Hj e δj, cösa ch’a l’indica che i germoplasmi an de differense scignificative inta plastiçitæ de seu respòste metabòliche a-i erbivoi (figua S7). St’organizzaçion a l’arregòrda de osservaçioin passæ in sciâ gamma dinamica di cangi de JA provocæ da-i erbivoi e a l’à mantegnuo un valô assæ erto inte unna popolaçion sencia (26, 36). Pe mezo de JA e JA-Ile pe verificâ a correlaçion de livello complescivo tra Hj e δj, emmo nottou ch’existe unna correlaçion poxitiva scignificativa tra JA e l’indiçe de diverscitæ e speçializzaçion do metabòloma β (figua S7). Questo o suggerisce che l’eterogeneitæ induta da-i erbivoi inte l’induçion de JA relevâ à livello de popolaçion a peu ëse dovua à di polimorfismi metabòlichi ciave provocæ da-a seleçion di insetti erbivoi.
Di studdi preçedenti an demostrou che i tipi de tabacco differiscian ben ben inta qualitæ e inta dependensa relativa da-e defeise metabòliche indute e constitutive. Se pensa che sti cangi inta trasduçion do segnâ antierbivoro e inte capaçitæ de defeisa seggian regolæ da-a prescion da popolaçion di insetti, da-o çiclo de vitta de ciante e da-i costi da produçion de defeisa into niccio donde cresce unna çerta speçie. An studiou a coerensa do remodellamento do metabòloma de feugge provocou da-i erbivoi de sëi speçie de Nicotiana originäie de l’America do Nòrd e do Sud. Ste speçie en affinæ streitamente a-o Nepente de l’America do nòrd, saieiva à dî Nicolas Bociflo. La, N. nicotiña, nicoçiaña n. erba attenuâ, tabacco de nicoçia, tabacco lineare, tabacco (nicoçia spegazzinii) e tabacco à feuggia de tabacco (figua 5A) (37). Sëi de ste speçie, compreiso a speçie ben caratterizzâ N. please, en de ciante annuale do clado da petunia e e ottuxifòlle N. en de ciante perenne do clado seu Trigonophyllae (38). Pe conseguensa, l’induçion W + W, W + OSM e W + OSS1 a l’é stæta fæta in sce ste sette speçie pe studiâ o redispoxiçion metabòlico à livello de speçie de l’alimentaçion di insetti.
(A) Un erbo filogenetico de sciortia basou in sciâ mascima probabilitæ [pe-a scintexi da glutamina nucleare (38)] e in sciâ distribuçion geografica de sette speçie de Nicotiana ligæ streitamente (coî differenti) (37). (B) Un grafico de diffuxon de diverscitæ speçializzâ pe-i profî metabòlichi de sette speçie de nicoçia (939 MS/MS; file de dæti S1). À livello de speçie, a diverscitæ do metabòloma a l’é correlâ negativamente co-o graddo de speçializzaçion. L’analixi da correlaçion à livello de speçie tra a diverscitæ metabòlica e a speçializzaçion e l’accumulo de JA a se vedde inta figua 2. S9. Colore, tipi despægi; triangolo, W + OSS1; rettangolo, W + OSM; (C) E dinamiche de JA e JA-Ile de Nicotiana son clascificæ in base à l'ampiessa d'eccitaçion de l'OS (ANOVA à doî sensci e confronto pòst-moltiplo de Tukey HSD, * P <0,05, ** P <0,01 e * ** Pe-o confronto de W + OS e W + W, P <0,001). Grafico à scatoa de (D) diverscitæ e (E) speçializzaçion de tutte e speçie dòppo avei scimolou JA erbivoro e metilico (MeJA). L'asterisco o l'indica a differensa scignificativa tra W + OS e W + W ò lanoliña ciù W (Lan + W) ò Lan ciù MeJA (Lan + MeJa) e o contròllo Lan (analixi à doî sensci da variansa, e apreuvo o confronto moltiplo post hoc HSD do Tukey, *P<0,05, **P<0,01 e 1).
Pe mezo do metodo à doî gruppi, emmo identificou 9 mòdoli de 939 MS/MS (file de dæti S1). A compoxiçion de MS/MS reconfiguræ da diversci trattamenti a cangia ben ben tra diversci mòdoli tra e speçie (figua S8). A visualizzaçion de Hj (dita chì diverscitæ γ à livello de speçie) e δj a revela che de speçie diverse s’aggregan inte di gruppi assæ diversci into spaçio metabòlico, donde a divixon à livello de speçie pe-o sòlito a l’é ciù prominente che l’eccitaçion. Con l’ecceçion de N. linear e N. obliquus, mostran unna larga gamma dinamica d’effetti d’induçion (figua 5B). Pe contra, de speçie comme N. purpurea e N. obtusifolia an unna respòsta metabòlica meno òvvia a-o trattamento, ma o metabòloma o l’é ciù diverso. A distribuçion speçifica da respòsta metabòlica induta a l’à portou à unna correlaçion negativa scignificativa tra a speçializzaçion e a diverscitæ gamma (PCC = -0,46, P = 4,9×10-8). I cangi induti da l’OS inti livello de JA en correlæ poxitivamente co-a speçializzaçion do metabòloma e negativamente co-a diverscitæ gamma metabòlica mostrâ da tutte e speçie (figua 5B e figua S9). Va dito che e speçie indicæ colloquialmente comme speçie de «responsa segnâ» inta figua 5C, comme i nematödi de Nepente, o Nepente, o Nepente aguo e o Nepente attenuou, an provocou di segni scignificativi à 30 menuti. I fochi de JA e JA-Ile speçifichi pe-o OS che l’é vegnuo de reçente, mentre di atri battëi ciammæ «segnâ no respondente», comme i moin de Nepenthes, o Nepenthes in pövea e N. obtusifolia mostran solo che l’induçion de bordo de JA-Ile sensa nisciuña speçificitæ de OS (figua 5C). À livello metabòlico, comme stæto dito primma, pe-i Nepenthes attenuæ, e sostanse che respondan a-o segnâ an mostrou a speçificitæ de OS e an aumentou scignificativamente δj, tanto che reduxeivan Hj. St’effetto priming speçifico pe OS o no l’é stæto nottou inte speçie clascificæ comme speçie no reattive pe-o segnâ (figua 5, D e E). I metaboliti speçifichi pe OS vëgnan scompartii ciù de spesso tra e speçie che respondan a-o segnâ e sti gruppi de segnæ s’aggruppan con de speçie con de respòste à segnâ ciù debole, mentre e speçie con de respòste à segnâ ciù debole mostran ciù pöca interdependensa (figua S8). Sto resultato o l’indica che l’induçion speçifica de JA pe OS e a reconfiguraçion speçifica pe OS do metabòloma downstream en accobbiæ à livello de speçie.
Pe avanti emmo deuviou unna pasta de lanoliña ch’a contëgne JA de metil (MeJA) pe trattâ e ciante pe indagâ se ste modalitæ d’accobbio en restreite da-a disponibilitæ de JA applicou da JA esogeno, ch’o saià into citoplasma de ciante. A deesterificaçion spedia a l’é JA. Noemme l’é stæto attrovou a mæxima tendensa do cangio gradduale da-e speçie che respondan a-o segnâ à quelle che no respondan a-o segnâ provocou da-a fornitua continua de JA (figua 5, D e E). À dîla curta, o trattamento con MeJA o l’à reprogrammou fortemente i metabòlimi di nematödi lineari, N. obliquus, N. aquatico, N. pallen e N. mikimotoi, co-o resultato de un aumento scignificativo de δj e de unna diminuçion de Hj. N. purpurea o l’à mostrou solo che un aumento de δj, ma no de Hj. N. obtusifolia, ch’o l’à demostrou in preçedensa d’ammuggiâ di livello estremamente basci de JA, o responde ascì pöco a-o trattamento con MeJA in termini de reconfiguraçion do metabòloma. Sti resultati indican che a produçion de JA ò a trasduçion do segnâ a l’é fixològicamente restreita inte speçie che no respondan a-o segnâ. Pe verificâ st’ipòtexi emmo studiou e quattro speçie (N. pallens, N. moin, N. rosa e N. microfilla) indute da W + W, W + OSM e W + OSS1 (39). In coerensa co-o modello de remodellaçion do metabòloma, e speçie en ben separæ into spaçio do trascrittòma, tra i quæ N. attenuou o l’à mostrou o RDPI induto da l’OS ciù erto, mentre N. gracilis o l’aiva o ciù basso (figua 6A). À tutti i mòddi, s’é nottou che a diverscitæ do trascrittòmico induta da N. oblonga a l’ea a ciù bassa tra e quattro speçie, a-o conträio da diverscitæ metabonòmica ciù erta de N. oblonga mostrâ primma inte sette speçie. Di studdi preçedenti an demostrou che un insemme de geni ligæ à di primmi segnæ de defeisa, compreiso i segnæ JA, o spiega a speçificitæ de primme respòste de defeisa indute da di eliçitoî ligæ à l’erbivoi inte speçie de Nicotiana (39). O confronto di percorsci de segnalaçion JA tra ste quattro speçie o l’à revelou un modello interessante (figua 6B). A ciù parte di geni de sto percorso, comme AOC, OPR3, ACX e COI1, an mostrou di livello relativamente erti d’induçion inte ste quattro speçie. À tutti i mòddi, un gene ciave, JAR4, o converte JA inta seu forma biologicamente attiva de trascriçioin ammuggiæ da JA-Ile e o seu livello de trasmiscion o l’é assæ basso, mascime inte N. mills, Nepenthes pieris e N. microphylla. Pe de ciù, solo che a trascriçion de un atro gene AOS a no l’é stæta individuâ inte N. bifidum. Sti cangi inte l’esprescion genica peuan ëse responsabili di fenotipi estremi induti da-a bassa produçion de JA inte speçie anergiche de segnâ e da l’induçion de N. gracilis.
(A) Analixi da teoria de l’informaçion da reprogrammaçion de primme respòste trascriçionale de quattro speçie de tabacco ligæ streitamente campionæ 30 menuti dòppo l’induçion de l’erbivoro. O RDPI o ven carcolou confrontando e feugge indute da l’OS erbivoro co-o contròllo de ferie. I coî indican de speçie despæge e i scimboli indican di despægi metodi de trattamento. (B) Analixi de l’esprescion genica inti percorsci de segnalaçion JA tra quattro speçie. O percorso JA semplificou o vëgne mostrou da-a rente a-o grafico da casella. Di coî despægi indican di despægi metodi de trattamento. L'asterisco o l'indica che gh'é unna differensa scignificativa tra-o trattamento W + OS e o contròllo W + W (pe-o test t do Student pe-e differense in cobbia, *P<0,05, **P<0,01 e ***P<0,001). OPDA, açido 12-ossofitodienòico; OPC-8: açido 0,3-osso-2(2′(Z)-pentenilo)-çiclopentan-1-ottanòico.
Inte l’urtima parte emmo studiou comme o remodellamento speçifico de speçie d’insetti do metabòloma de diverse speçie de ciante o peu ëse rescistente a-i erbivoi. E reçerche preçedente an enfatizzou o genere Nicotiana. A seu rexistensa a-e Ms e a-e larve a differisce ben ben (40). Chì emmo studiou a connescion tra sto modello e a seu plastiçitæ metabòlica. Pe mezo de quattro speçie de tabacco stæte mensunæ de d’ato, e verificando a correlaçion tra a diverscitæ e a speçializzaçion do metabòloma provocâ da-i erbivoi e a rexistensa de ciante à Ms e Sl, emmo attrovou che a rexistensa, a diverscitæ e a speçializzaçion a-o generalista Sl Tutte en correlæ poxitivamente, tanto che a correlaçion scignificativa a diverscitæ esperte a no l’é co-a Fig. S10). Pe quello ch’o l’à da fâ co-a rexistensa à S1, tanto a N. chinensis attenuâ comme a N. gracilis, che in preçedensa s’é demostrou tanto di livello de trasduçion do segnâ JA comme da plastiçitæ do metabòloma, aivan de respòste ben ben despæge à l’induçion di erbivoi e mostravan ascì unn’erta rexistensa pægia. Sesso.
Inti urtimi sessanta anni, a teoria da defeisa de ciante a l’à fornio un quaddro teòrico, in sciâ base do quæ i reçercatoî an predito unna quantitæ consciderevole d’evoluçioin e fonçioin de metaboliti speçializzæ inte ciante. E ciù tante de ste teorie no van apreuvo a-a proçedua normale de fòrte inferense (41). Propoñan de previxoin ciave (3) a-o mæximo livello d'analixi. Quande a verifica de previxoin ciave a permette d'analizzâ de teorie particolæ, sto chì o l'anià avanti o campo. Se sostegni, ma refuâ i atri (42). A-o conträio, a neuva teoria a fa de previxoin à di livelli differenti d'analixi e a l'azzonze un neuvo livello de conscideraçioin descrittive (42). À tutti i mòddi, e doe teorie propòste à livello fonçionale, MT e OD, peuan vegnî spiegæ de lengê comme de previxoin importante de cangi metabòlichi speçializzæ provocæ da-i erbivoi: a teoria OD a credde che i cangi into «spaçio» metabòlico speçializzou seggian assæ direçionali. A teoria MT a credde che sti cangi saian no direçionali e collocæ à un mòddo casuale into spaçio metabòlico e tendan à avei di metaboliti d’erto valô de defeisa. Di exammi passæ de previxoin de OD e MT en stæti verificæ pe mezo de un insemme streito de compòsti de «defeisa» a priori. Sti test çentræ in scî metaboliti impediscian a capaçitæ d’analizzâ l’estenscion e a trajettöia da reconfiguraçion do metabòloma durante l’erbivoia e no permettan de preuve inte un quaddro statistico coerente pe domandâ de previxoin ciave che peuan vegnî conscideræ into seu insemme Quantificâ i cangi into metabòlòma de ciante. Chì emmo addeuviou a tecnologia innovativa inta metabòmica basâ in sciâ MS computaçionale e emmo fæto unn’analixi de MS de deconvoluçion inta monæa generale di descrittoî da teoria de l’informaçion pe verificâ a distinçion tra-i doî propòsti à livello de metabòlica globale. A previxon ciave de sta teoria. A teoria de l'informaçion a l'é stæta applicâ inte tanti campi, sorvetutto into contesto da biodiverscitæ e da reçerca in sciô flusso de nutrienti (43). À tutti i mòddi, pe quello che semmo, sta chì a l’é a primma applicaçion deuviâ pe descrive o spaçio d’informaçion metabòlica de ciante e pe resòlve di problemi ecològichi ligæ a-i cangi metabòlichi temporanei in respòsta à di indiçi de l’ambiente. Ciù into dettaggio, a capaçitæ de sto metodo a l’é inta seu capaçitæ de confrontâ di modelli drento e tra e speçie de ciante pe examminâ comme i erbivoi se son evolui da diverse speçie à di modelli macroevolutivi interspeçie à diversci livello d’evoluçion. Metabolismo.
L’analixi di componenti prinçipæ (PCA) a converte un insemme de dæti multivariou inte un spaçio de reduçion da dimenscionalitæ de mòddo che a tendensa prinçipâ di dæti a pòsse vegnî spiegâ, donca pe-o sòlito a ven deuviâ comme tecnica d’esploraçion pe analizzâ l’insemme de dæti, comme o metabòloma de deconvoluçion. À tutti i mòddi, a reduçion da dimenscion a perdià unna parte do contegnuo d’informaçioin inte l’insemme de dæti e o PCA o no peu fornî de informaçioin quantitative in scê caratteristiche ch’en particolarmente importante pe-a teoria ecològica, comme: comme i erbivoi configuran torna a diverscitæ inte di campi speçializzæ (comme ricchessa, distribuçion) e abbondansa) di metaboliti? Quæ metaboliti en di preditoî do stato induto de un çerto erbivoro? Da-o ponto de vista da speçificitæ, da diverscitæ e de l’induçibilitæ, o contegnuo d’informaçioin do profî de metabolito speçifico pe-e feugge o se decompòñe e s’attreuva che o mangiâ di erbivoi o peu attivâ un metabolismo speçifico. À un mòddo inaspëtou, emmo osservou che, comme descrito inti indicatoî da teoria de l’informaçion implementæ, a scituaçion metabòlica ch’a ne sciòrte a l’à unna gran sorvepoxiçion dòppo i attacchi di doî erbivoi (o generalista Sl alimentou da neutte) e l’esperta de Solanaceae Ms. Sciben che o seu comportamento d’alimentaçion e a seu conçentraçion son scignificativamente despægi. L’iniçiatô de coniugou açido grasso-aminoaçido (FAC) inte l’OS (31). Pe mezo de l’OS erbivoro pe trattâ e ferie de pontuaçion standardizzæ, o trattamento erbivoro scimolou o l’à mostrou ascì unna tendensa pægia. Sta proçedua standardizzâ pe scimolâ a respòsta de ciante a-i attacchi di erbivoi a l’elimina i fattoî de confuxon provocæ da-i cangi into comportamento alimentare di erbivoi, che pòrtan à di graddi variabili de danno inte di tempi differenti (34). A FAC, ch’a l’é conosciua comme a causa prinçipâ de l’OSM, a redue a JAS e e atre respòste ormonale de ciante inte OSS1, mentre che OSS1 o reduxe çentanæa de vòtte (31). À tutti i mòddi, OSS1 o l’à provocou di livelli d’accumulo de JA someggianti à quelli de OSM. In passou l’é stæto demostrou che a respòsta JA inte Nepenthes attenuæ a l’é assæ senscibile à l’OSM, donde o FAC o peu mantegnî a seu attivitæ ascì se diluio 1:1000 con de l’ægua (44). De conseguensa, in confronto à l’OSM, sciben che o FAC inte OSS1 o l’é assæ basso, o l’é abasta pe indue unn’epidemia de JA assæ. Di studdi preçedenti an demostrou che e proteiñe che s’assumeggian à de porine (45) e i oligosaccaridi (46) peuan vegnî deuviæ comme indiçi molecolari pe arvî de respòste de defeisa de ciante inte OSS1. À tutti i mòddi, no l’é ancon ciæo se sti eliçitoî inte OSS1 son responsabili de l’accumulo de JA osservou into studio d’ancheu.
Sciben che gh’é pöchi studdi che descrivan e impronte digitale metabòliche differensiæ provocæ da l’applicaçion de diversci erbivoi ò JA ò SA esogeni (açido saliçilico) (47), nisciun o l’à perturbou a perturbaçion speçifica da speçie erbivora inta ræ d’erba vegetale e i seu effetti in sciô metabolismo speçifico o l’é complescivo. informaçioin personale. St’analixi a l’à confermou pe de ciù che a connescion da ræ ormonale interna con di atri ormoin de ciante diversci da-i JA a modella a speçificitæ da reorganizzaçion metabòlica provocâ da-i erbivoi. In particolâ, emmo nottou che l'ET provocou da OSM o l'ea scignificativamente ciù grande de quello provocou da OSS1. Sta modalitæ a l'é coerente con ciù contegnuo de FAC inte OSM, ch'a l'é unna condiçion neçessäia e suffiçiente pe descadenâ un burst ET (48). Into contesto de l’interaçion tra ciante e erbivoi, a fonçion de segnalaçion de ET in sciâ dinamica di metaboliti speçifichi pe-e ciante a l’é ancon sporadica e a mira solo che à un gruppo compòsto sencio. Pe de ciù, a ciù parte di studdi a l’à deuviou l’applicaçion esogena d’ET ò di seu precursoî ò diversci inibitoî pe studiâ a regolaçion de l’ET, tra e quæ ste applicaçioin chimiche esogene produian tanti effetti segondäi no speçifichi. À nòstra conoscensa, sto studio o representa o primmo examme scistematico in sce larga scâ do ròllo de l’ET inte l’utilizzaçion de l’ET pe produe e perçepî de ciante trasgeniche compromesse pe coordinâ a dinamica do metabòloma de ciante. L’induçion de ET speçifica pe erbivoi a peu in sciâ fin modulâ a respòsta do metabòloma. A ciù scignificativa a l’é a manipolaçion trasgenica di geni da bioscintexi ET (ACO) e da perçeçion (ETR1) ch’a l’à revelou l’accumulo de novo de fenolamide speçifico pe-i erbivoi. L’é stæto demostrou in preçedensa che ET o peu accordâ l’accumulo de nicotiña induto da JA co-a regolaçion da N-metiltrasferaxi da putresciña (49). À tutti i mòddi, da un ponto de vista mecanico, no l’é ciæo comme ET o l’accorda l’induçion da fenamide. In azzonta a-a fonçion de trasduçion do segnâ de ET, o flusso metabòlico o peu vegnî deviou ascì à S-adenosil-1-metioniña pe regolâ l’investimento inte amide de poliaminofenölo. A S-adenosil-1-metioniña a l’é ET e intermedio commun do percorso bioscintetico de poliamine. O mecanismo pe mezo do quæ o segnâ ET o regola o livello de fenolamida o l’à de beseugno de un atro studio.
Pe tanto tempo, apreuvo a-a gran quantitæ de metaboliti particolæ de struttua desconosciua, l’attençion intensa à de categorie metabòliche speçifiche a no l’é stæta boña à valuâ streitamente i cangi temporali da diverscitæ metabòlica dòppo e interaçioin biològiche. A-o momento, in sciâ base de l’analixi da teoria de l’informaçion, o resultato prinçipâ de l’aquixiçion do spettro MS/MS basou in scî metaboliti imparçiali o l’é che i erbivoi che mangian ò scimolan di erbivoi van avanti à redue a diverscitæ metabòlica complesciva do metabòloma de feugge, aumentando tanto o seu graddo de speçializzaçion. Sto aumento temporaneo da speçificitæ do metabòloma provocou da-i erbivoi o l’é assoçiou à un aumento sinergico da speçificitæ do trascrittòma. A caratteristica ch’a contribuisce ciù tanto à sta speçializzaçion do metabòloma ciù grande (ch’a l’à un valô de Si ciù erto) o l’é o metabolito particolare co-a fonçion erbivora caratterizzâ primma. Sto modello o l’é coerente co-a previxon da teoria OD, ma a previxon da MT ligâ a-o caxo da reprogrammaçion do metabòloma a no l’é coerente. À tutti i mòddi, sti dæti en coerenti ascì co-a previxon do modello mesccio (megio MT; figua 1B), perché di atri metaboliti no caratterizzæ con de fonçioin de defeisa desconosciue peuan ancon anâ apreuvo à unna distribuçion casuale de Si.
Un modello degno de nòtta cattuou ancon da sta reçerca o l’é che da-o livello de microevoluçion (popolaçion de ciante e tabacco sencia) à unna scâ evolutiva ciù larga (speçie de tabacco ligæ streitamente), diversci livelli d’organizzaçion evolutiva son inta «megio defeisa». Gh’é de differense scignificative inte capaçitæ di erbivoi. Moore e atri. (20) e o Kessler e o Kalske (1) an propòsto de forma independente de convertî i trei livelli fonçionali de biodiverscitæ distinti a-o comenso da-o Whittaker (50) inti cangi temporali constitutivi e induti da diverscitæ chimica; sti autoî no an fæto unna riassunto E proçedue pe l’arrecuggeita di dæti do metabòloma in sce larga scâ no delinian ascì comme carcolâ a diverscitæ metabòlica da sti dæti. Inte sto studio, de modifiche ciù picciñe a-a clascificaçion fonçionale de Whittaker conscideran a diverscitæ α-metabòlica comme a diverscitæ di spettri MS/MS inte unna çerta cianta e a diverscitæ β-metabòlica comme metabolismo intraspeçifico de base de un gruppo de popolaçioin.
O segnâ JA o l’é essençiale pe unna larga gamma de respòste metabòliche erbivore. À tutti i mòddi, gh’é unna farta de verifiche quantitative rigorose do contributo da regolaçion intraspeçifica da bioscintexi de JA a-a diverscitæ do metabòloma e se o segnâ de JA o segge un scito generale pe-a diverscifficaçion metabòlica induta da-o stress in sce unna scâ macroevolutiva ciù erta o l’é ancon eluxivo. Noemmo l’emmo osservou che a natua erbivora de l’erbivoro de Nepenthes a l’induxe a speçializzaçion do metabòlòma e a variaçion da speçializzaçion do metabòlòma drento da popolaçion de speçie de Nicotiana e tra e speçie de Nicotiana ligæ streitamente a l’é scistematicamente correlâ poxitivamente co-a segnalaçion JA. Pe de ciù, quande o segnâ JA o l’é compromisso, a speçificitæ metabòlica induta da un erbivoro de un solo genotipo a saià annullâ (figua 3, C e E). Dæto che i cangi do spettro metabòlico de popolaçioin de Nepente attenuæ pe natua en pe-o ciù quantitativi, i cangi inta diverscitæ e inta speçificitæ metabòlica β inte st’analixi peuan ëse provocæ pe-a ciù parte da-a fòrte eçitaçion de categorie de compòsti ricchi de metaboliti. Ste classe compòste dominan unna parte do profî do metabòloma e pòrtan à unna correlaçion poxitiva co-i segnæ JA.
Dæto che i meccanismi biochimichi da speçie de tabacco ligæ streitamente à lê en assæ despægi, i metaboliti en identificæ into dettaggio inte l’aspeto qualitativo, donca o l’é ciù analitico. L’elaboraçion do profî metabòlico cattuou da parte da teoria de l’informaçion a mostra che l’induçion erbivora a l’aggrava o compromisso tra a diverscitæ gamma metabòlica e a speçializzaçion. O segnâ JA o zeuga un ròllo çentrale inte sto compromisso. L’aumento da speçializzaçion do metabòloma o l’é coerente co-a previxon prinçipâ de OD e o l’é correlou poxitivamente co-o segnâ JA, mentre o segnâ JA o l’é correlou negativamente co-a diverscitæ gamma metabòlica. Sti modelli indican che a capaçitæ de OD de ciante a l’é determinâ pe-o ciù da-a plastiçitæ de JA, tanto in sce unna scâ microevolutiva comme in sce unna scâ evolutiva ciù larga. I esperimenti d’applicaçion esogeni de JA che schivan i difetti da bioscintexi de JA revelan pe de ciù che e speçie de tabacco ligæ streitamente peuan vegnî distinte inte speçie che respondan a-o segnâ e no, comme a seu modalitæ de JA e a plastiçitæ do metabòloma induta da-i erbivoi. E speçie che no respondan a-o segnâ no peuan responde apreuvo a-a seu incapaçitæ de produe JA endògena e donca en soggette à de limitaçioin fisiològiche. Sto fæto o peu vegnî provocou da de mutaçioin inte çerti geni ciave into percorso de segnalaçion JA (AOS e JAR4 inte N. crescens) de. Sto resultato o mette in luxe che sti modelli macroevolutivi interspeçie peuan ëse guiddæ pe-o ciù da di cangi inta perçeçion e inta responcivitæ di ormoin interni.
In azzonta à l’interaçion tra ciante e erbivoi, l’esploraçion da diverscitæ metabòlica a l’é ligâ à tutti i progresci teòrichi importanti inta reçerca in sce l’adattamento biològico à l’ambiente e inte l’evoluçion de tratti fenotipichi complesci. Co-o cresce da quantitæ de dæti ottegnui da-i moderni strumenti de MS, e verifica d’ipòtexi in sciâ diverscitæ metabòlica oua peuan anâ a-o de là de differense de metaboliti individuali/categorii e effettuâ de analixi globale pe revelâ di modelli inatteisi. Into proçesso d’analixi in sce larga scâ, unna metafora importante a l’é l’idea de conçepî de mappe scignificative che peuan ëse deuviæ pe esplorâ i dæti. De conseguensa, un exito importante da combinaçion d’ancheu de metabolomica imparçiale MS/MS e teoria de l’informaçion o l’é ch’a fornisce unna metrica sencia ch’a peu vegnî deuviâ pe costrue de mappe pe navigâ a diverscitæ metabòlica in sce scæ tassonòmiche despæge. O l’é o requixito de base de sto metodo. O studio de l’evoluçion micro/macro e de l’ecologia da communitæ.
À livello macroevolutivo, o cheu da teoria da coevoluçion ciante-insetto de Ehrlich e Raven (51) o l’é de prevedde che a variaçion da diverscitæ metabòlica interspeçie a segge a causa da diverscifficaçion di lignæghi de ciante. Però, inti çinquant'anni da-a pubricaçion de sto travaggio fondamentale, st'ipòtexi a l'é stæta verificâ de ræo (52). Questo o l’é dovuo pe-a ciù parte a-e caratteristiche filogenetiche de caratteristiche metabòliche che se peuan confrontâ tra di lignæghi de ciante à longa distansa. A rarietæ a peu ëse deuviâ pe ancorâ di metodi d’analixi do bersalio. O flusso de travaggio MS/MS d’ancheu elaborou da-a teoria de l’informaçion o quantifica a sumeggiansa strutturale MS/MS de metaboliti desconosciui (sensa seleçion preçedente di metaboliti) e o converte sti MS/MS inte un insemme de MS/MS, donca into metabolismo profescionale Sti modelli macroevolutivi vëgnan confrontæ in sce scâ de clascificaçion. Indicatoî statistichi senci. O proçesso o s’assumeggia à l’analixi filogenetica, ch’a peu deuviâ l’allineamento de sequense pe quantificâ o tasso de diverscifficaçion ò d’evoluçion do carattere sensa unna previxon preçedente.
À livello biochimico, l’ipòtexi de screening de Firn e Jones (53) a mostra che a diverscitæ metabòlica a se mantëgne à di livelli differenti pe fornî de matëie primme pe exerçitâ e attivitæ biològiche de metaboliti che in passou no ean ligæ ò sostituii. I metodi da teoria de l’informaçion forniscian un quaddro donde ste tranxiçioin evolutive speçifiche pe-i metaboliti che se verifican durante a speçializzaçion di metaboliti peuan vegnî quantificæ comme parte do proçesso de screening evolutivo propòsto: adattamento biologicamente attivo da bassa speçificitæ à erta speçificitæ Metaboliti inibii inte un çerto ambiente.
Inte l’insemme, inti primmi giorni da biologia molecolare s’é sviluppou de teorie importante in sciâ defeisa de ciante e i metodi deduttivi basæ in scê ipòtexi en conscideræ pe commun comme l’unico mezzo de progresso scientifico. Sto fæto o l’é dovuo pe-a ciù parte a-e limitaçioin tecniche da mesuaçion do metabòloma intrego. Sciben che i metodi basæ in scê ipòtexi son particolarmente utili inta çernia d'atri meccanismi de caxon, a seu capaçitæ de fâ anâ avanti a nòstra comprenscion de ræ biochimiche a l'é ciù limitâ che i metodi computaçionali che gh'é ancheu inta sciensa d'intenscivitæ de dæti d'ancheu. Pe quello, e teorie che no peuan ëse previste van ben ben a-o de là do campo di dæti à dispoxiçion, donca a formola ipotetica/çiclo de preuva do progresso into campo da reçerca a no peu ëse abolia (4). Prevedemmo che o flusso de travaggio computaçionale da metabolomica introduto chì o pòsse arvî torna l’interesse pe-e costioin (comme) e finale (perché) da diverscitæ metabòlica ch’en vegnue de reçente e contribuî à unna neuva era da sciensa di dæti guiddâ da-o ponto de vista teòrico. L'epoca a l'à examinou torna e teorie importante ch'aivan ispirou e generaçioin passæ.
L’alimentaçion diretta di erbivori a se fa con l’allevamento de unna segonda larva instar ò larva Sl in sce unna sola feuggia de cianta pitcher de cô pâ de unna sola cianta ch’a scioî de rose, con 10 replicæ de cianta pe cianta. E larve di insetti vegnivan serræ con de morse e o tesciuo de feuggie ch’o l’arrestava o vegniva recuggeito 24 e 72 oe dòppo l’infeçion e congelou a-a spedia, e i metaboliti vegnivan estræti.
Scimolâ o trattamento erbivoro inte unna mainea assæ scincronizzâ. O metodo o l’é de deuviâ de reue à modello de tesciuo pe perforâ træ fie de spine in sce tutte e bande da çernia media de træ feugge completamente allargæ da cianta durante o stadio de crescita da ghirlanda de tesciuo e applicâ de botto 1:5 Diluted Ms. Ò deuviâ de die con di guanti pe perforâ S1 OS into OS. Recuggeite e travaggiæ unna feuggia comme descrito chì de d’ato. Deuviâ o metodo descrito primma pe estrâ di metaboliti primmäi e di ormoin de ciante (54).
Pe-e applicaçioin esogene de JA, e træ feuggie à peçio de ciascheduña de sëi ciante da scioî de rose de ciascheduña de speçie vëgnan trattæ con 20 μl de pasta de lanoliña ch’a contëgne 150 μg de MeJA (Lan + MeJA) e 20 μl de lanoliña ciù trattamento pe-e ferie (Lan + MeJA) ò deuviâ comme purificaçion de contròllo pe-e ferie (Lan + MeJA). E feuggie en stæte recuggeite 72 oe dòppo o trattamento, congelæ à sciacco inte de l’azöto liquido e conservæ à -80°C fin à l’utilizzaçion.
Into nòstro gruppo de reçerca l’é stæto identificou quattro linie trasgeniche JA e ET, saieiva à dî irAOC (36), irCOI1 (55), irACO e sETR1 (48). irAOC o l’à mostrou fortemente unna diminuçion di livello de JA e JA-Ile, tanto che irCOI1 o no l’ea senscibile a-i JA. In confronto à EV, l'accumulo de JA-Ile o l'é aumentou. Do mæximo, irACO o reduià a produçion d’ET e in confronto à EV, sETR1, ch’o l’é insenscibile à ET, o l’aumentià a produçion d’ET.
Un spettrometro laser fotoacustico (sensô ET in tempo reale Sensor Sense ETD-300) o vëgne addeuviou pe exeguî a mesuaçion ET de mainea no invasiva. De botto dòppo o trattamento, a meitæ de feugge a l’é stæta taggiâ e stramuâ inte unna fiala de veddro serrâ de 4 ml, e o spaçio pe-a testa o s’é lasciou ammuggiâ drento de 5 oe. Inta mesuaçion, ògni fialetta a l'é stæta sciaccâ con un flusso de 2 litri/oa d'äia pua pe 8 menuti, ch'o l'ea passou in passou pe un catalizzatô fornio da Sensor Sense pe remeuve o CO2 e l'ægua.
I dæti de micromatrixe en stæti pubricæ a-o comenso into (35) e sarvæ inta base de dæti completa d’esprescion genica do Çentro naçionale pe l’informaçion in scê biotecnologie (NCBI) (numero d’açescion GSE30287). I dæti correspondenti a-e feugge provocæ da-o trattamento con W + OSM e da-o contròllo no dannezzou en stæti estræti pe sto studio. L’intensitæ gròssa a l’é log2. Avanti de l’analixi statistica, a linia de base a l’é stæta convertia e normalizzâ a-o seu 75° perçentile pe mezo do pacchetto software R.
I dæti originali de sequensiamento de l’RNA (RNA-seq) da speçie de Nicotiana en stæti repiggiæ da-i archivi de lettua curta do NCBI (SRA), o numero do progetto o l’é PRJNA301787, ch’o l’é stæto reportou da Zhou et al. (39) e proçedî comme descrito into (56). I dæti gròsci elaboæ da W + W, W + OSM e W + OSS1 correspondenti a-e speçie de Nicotiana en stæti seleçionæ pe l’analixi inte sto studio e elaboæ à sta mainea: pe primma cösa, e lettue gròsse de RNA-seq en stæte convertie into formato FASTQ. HISAT2 o converte FASTQ inte SAM e SAMtools o converte i file SAM inte di file BAM ordinai. StringTie o ven deuviou pe carcolâ l’esprescion genica e o seu metodo d’esprescion o l’é che gh’é di frammenti pe mille frammenti de base pe mioin de frammenti de trasmiscion sequensiæ.
A chinòlla cromatografica Acclaim (150 mm x 2,1 mm; dimenscion de partiçelle 2,2 μm) deuviâ inte l'analixi e a chinòlla de guardia de 4 mm x 4 mm son fæte do mæximo materiale. O gradiente binäio ch’o vëgne apreuvo o vëgne deuviou into scistema de cromotografia liquida à erte prestaçioin (UHPLC) Dionex UltiMate 3000: da 0 à 0,5 menuti, isòcratico 90% A [ægua deionizzâ, 0,1% (v/v) d’açetonitrilo e 0,05% d’açido B pe1 0,05% de açido fòrmico); 0,5 à 23,5 menuti, a fase de gradiente a l’é 10% A e 90% B, rispettivamente; 23,5 à 25 menuti, isòcratico 10% A e 90% B. O tasso de portâ o l'é de 400μl/min. Pe tutte e analixi de MS, iniettâ l'eluente à chinòlla inte un analizzatô quadrupòlo e tempo de xeuo (qTOF) fornio con unna vivagna d'elettrospray ch'a fonçioña in modalitæ d'ionizzaçion poxitiva (tenscion capillâ, 4500 V; sciortia capillâ 130 V ; Temperatua de seccatua 200°C d1).
Exeguî unn’analixi de frammenti MS/MS (ciammæ inte sto chì MS/MS) ch’a no l’é pertinente ò ch’a no se peu distingue da-i dæti pe ottegnî de informaçioin strutturale in sciô profî metabòlico complescivo ch’o se peu nottâ. O conçetto do metodo MS/MS indiscriminou o se basa in sciô fæto che o quadrupòlo o l’à un barcon d’isolamento de massa assæ grande [donca, conscidere tutti i segnæ do rappòrto massa-carrega (m/z) comme di frammenti]. Pe sta raxon, dæto che o strumento Impact II o no l'é stæto bon de creâ unn'inclinaçion CE, l'é stæto fæto ciù analixi independente con deuviâ di valoî d'energia de collixon de dissoçiaçion (CE) provocæ da-a collixon aumentæ. À dîla curta, analizzâ primma o campion pe ionizzaçion à elettrospray UHPLC/qTOF-MS deuviando a modalitæ de spettrometria de massa sencia (condiçioin de frammentaçion bassa generæ da-a frammentaçion in vivagna), con scanscionâ da m/z 50 à 1500 con unna frequensa de repetiçion de 5 Hz. Deuviâ l’azöto comme gas de collixon pe l’analixi MS/MS e fâ de mesuaçioin independente a-e quattro tenscioin de dissoçiaçion indute da-a collixon che vëgnan apreuvo: 20, 30, 40 e 50 eV. Inte tutto o proçesso de mesuaçion, o quadrupòlo o l’à o barcon d’isolamento de massa ciù grande, da m/z 50 à 1500. Quande o còrpo davanti m/z e l’esperimento de larghessa d’isolamento o l’é misso in sce 200, l’intervallo de massa o l’é attivou automaticamente da-o software operativo do strumento e 0 Da. Scanscion pe-i frammenti de massa comme in modalitæ de massa sencia. Pe-a taratura de massa deuviâ o formæto de sòdio (50 ml d’isopropanölo, 200 μl d’açido fòrmico e 1 ml de soluçion aquosa de NaOH 1M). Pe mezo de l’algoritmo de taratua d’erta preçixon de Bruker, o file di dæti o ven tarao dòppo avei exeguio o spettro medio inte un çerto periodo de tempo. Utilizzâ a fonçion d'esportaçion do programma d'analixi di dæti v4.0 (Brook Dalton, Brema, Germania) pe convertî i file di dæti gròsci inte un formato NetCDF. L’insemme de dæti MS/MS o l’é stæto sarvou inta base de dæti de metabolòmica averta MetaboLights (www.ebi.ac.uk) co-o numero d’açescion. MTBLS1471.
L’assemblaggio MS/MS o peu ëse realizzou pe mezo de l’analixi de correlaçion tra i segnæ de qualitæ MS1 e MS/MS pe l’energia de collixon bassa e erta e de regole implementæ da neuva. O script R o vëgne deuviou pe realizzâ l’analixi de correlaçion da distribuçion do precursô a-o produto e o script C# (pipeline d’assemblaggio MS-MS indiscriminante) o vëgne deuviou pe implementâ e regole.
Pe redue i erroî fäsci poxitivi provocæ da-o rumô de fondo e a fäsa correlaçion provocâ da-o relevâ çerte caratteristiche m/z solo inte pöchi campioin, deuviemmo a fonçion “filled peak” do pacchetto R XCMS (pe-a correçion do rumô de fondo) Dovieiva ëse deuviou pe sostituî o “peak intenteu” (peak). Quande se deuvia a fonçion de çimma de riempimento, gh’é ancon ben ben di valoî d’intenscitæ “0′′ inte l’insemme de dæti che influensian o carcolo da correlaçion. Dapeu, se confronta i resultati de l’elaboraçion di dæti ottegnui quande se deuvia a fonçion de çimma de riempimento e quande a fonçion de çimma de riempio a no ven deuviâ, e carcolæ o valô de rumô de fondo corretto in sce sti valoî d’intenscitæ co-o valô de fondo carcolou Emmo consciderou ascì solo de caratteristiche che a seu intensitæ a passava træ vòtte o valô de fondo e ê emmo tegnue pe de «vee çimme». Pe-i carcoli de PCC vëgne piggiou in conscideraçion solo i segnæ m/z do precursô do campion (MS1) e i insemmi de dæti de frammenti co-o manco eutto çimme vee.
Se l'intensitæ da caratteristica de qualitæ precursoa into campion intrego a l'é scignificativamente in relaçion con l'intensitæ reduta da mæxima caratteristica de qualitæ ch'a l'é soggetta à unn'energia de collixon bassa ò erta e a caratteristica a no l'é marcâ comme un çimma isòtopico da-a CAMERA, a peu ëse definia ancon de ciù. Dapeu, carcolando tutte e cobbie precursore-produto poscibile drento de 3 s (o barcon de tempo de retençion stimou pe-a retençion de çimma), vëgne fæto l’analixi de correlaçion. Solo quande o valô de m/z o l'é ciù basso che o valô do precursô e a frammentaçion MS/MS a l'avvëgne inta mæxima poxiçion do campion inte l'insemme de dæti do precursô da-o quæ o ne vëgne, o l'é tegnuo pe un frammento.
In sciâ base de ste doe regole sence, s'escludde i frammenti speçificæ con di valoî m/z ciù grendi che quelli de m/z do precursô identificou e in sciâ base da poxiçion do campion donde o precursô o comparisce e do frammento speçificou. L’é ascì poscibile seleçionâ e caratteristiche de qualitæ generæ da tanti frammenti in-source generæ in modalitæ MS1 comme precursoî candidæ, generando coscì di compòsti MS/MS redondanti. Pe redue sta redondansa di dæti, se a sumeggiansa NDP di spettri a passa o 0.6 e appartëgnan a-o «gruppo pc» do cromatogramma annotou da CAMERA, î mescciemmo. Pe finî, mescciemmo tutti e quattro i resultati de CE ligæ a-o precursô e a-i frammenti into spettro compòsto deconvoluo finale, seleçionando a çimma d’intenscitæ ciù erta tra tutte e çimme candidæ co-o mæximo valô m/z à de energie de collixon despæge. I pasci d’elaboraçion che vëgnan apreuvo en basæ in sciô conçetto de spettro compòxito e tëgnan conto de diverse condiçioin CE neçessäie pe mascimizzâ a probabilitæ de frammentaçion, perché çerti frammenti peuan vegnî relevæ solo che con unna speçifica energia de collixon.
RDPI (30) o l’é stæto deuviou pe carcolâ l’induçibilitæ do profî metabòlico. A diverscitæ do spettro metabòlico (indiçe Hj) a ne vëgne da l’abbondansa de precursoî MS/MS pe mezo de l’entropia de Shannon da distribuçion de frequensa MS/MS pe mezo de l’equaçion ch’a vëgne apreuvo descrita da Martínez et al. (8). Hj = -∑i = 1mPijlog2(Pij) donde Pij o corresponde a-a frequensa relativa do i-° MS/MS into j-° campion (j = 1, 2,..., m) (i = 1, 2, ..., m) t).
A speçificitæ metabòlica (indiçe Si) a l'é definia comme l'identitæ d'esprescion de un çerto MS/MS in relaçion a-a frequensa tra-i campioin piggiæ in conscideraçion. A speçificitæ MS/MS a ven carcolâ comme Si = 1t (∑j = 1tPijPilog2PijPi)
Addeuviâ a formola chì apreuvo pe mesuâ l'indiçe δj speçifico do metabòloma de ògni campion j e a media da speçificitæ MS/MS δj = ∑i = 1mPijSi
I spettri MS/MS son allinæ in cobbie e a someggiansa a ven carcolâ in sciâ base di doî pontuaçioin. Pe primma cösa, deuviando o NDP standard (conosciuo ascì comme metodo de correlaçion cosinus), deuviâ l’equaçion ch’a ven apreuvo pe pontuâ a sumeggiansa do segmento tra i spettri NDP = (∑iS1 & S2WS1, iWS2, i) 2∑iWS1, i2∑iWS2, i2 donde S1 e S2 ben iWS1, correspondentemente, pe-o spettro, i o rappresenta o peiso basou in sce l’intensitæ de çimma che a differensa do i-° çimma commun tra i doî spettri a l’é ciù bassa de 0.01 Da. O peiso o vëgne carcolou comme segue: W = [intenscitæ de çimma] m [qualitæ] n, m = 0,5, n = 2, comme suggerito da MassBank.
L'é stæto implementou un segondo metodo de pontuaçion, ch'o comprendeiva l'analixi da NL scompartia tra MS/MS. Pe sta finalitæ emmo deuviou e 52 liste de NL che s’attreuvan de spesso durante o proçesso de frammentaçion de MS in tandem e a NL ciù speçifica (file de dæti S1) ch’a l’é stæta annotâ in preçedensa pe-o spettro MS/MS di metaboliti segondäi da speçie de Nepenthes debole ( 9, 26 ). Creâ un vettô binäio de 1 e 0 pe ògni MS/MS, ch’o corresponde a-o corrente e a-o inexistente de quarche NL rispettivamente. In sciâ base da sumeggiansa de distansa euclidea, o ponto de sumeggiansa NL o ven carcolou pe tutte e cobbie de vettoî NL binäi.
Pe effettuâ un cluster doggio emmo deuviou o pacchetto R DiffCoEx, ch’o se basa in sce unn’estenscion de l’analixi de coesprescion genica pondedâ (WGCNA). Pe mezo de matrixe de pontuaçion NDP e NL di spettri MS/MS, emmo addeuviou DiffCoEx pe carcolâ a matrixe de correlaçion comparativa. L’aggruppamento binäio o l’é fæto con l’impostaçion do parametro “cutreeDynamic” in sce metodo = “ibrido”, ertixe de taggio = 0,9999, divixon profonda = T e dimenscion de gruppo minima = 10. O còdiçe de vivagna R de DiffCoEx o l’é stæto telecargou da un file in ciù 1 da Tesson et al. (57); O pacchetto software R WGCNA neçessäio o se peu attrovâ inte WGCNA.
Pe fâ l’analixi da ræ molecolare MS/MS, emmo carcolou a connettivitæ spettrale in cobbia basâ in scî tipi de someggiansa NDP e NL e emmo deuviou o software Cytoscape pe visualizzâ a topologia da ræ pe mezo do layout organico inte l’applicaçion d’estenscion de l’algoritmo de layout CyFilescape yFiles.
Addeuviâ a verscion 3.0.1 de R pe fâ unn'analixi statistica in scî dæti. O scignificato statistico o l'é stæto valuou con deuviâ l'analixi de variansa à doî sensci (ANOVA), e apreuvo o test post-hoc da differensa onestamente scignificativa (HSD) do Tukey. Pe analizzâ a differensa tra-o trattamento erbivoro e o contròllo, a distribuçion à doe coe di doî gruppi de campioin co-a mæxima variansa a l'é stæta analizzâ con deuviâ o test t do Student.
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A teoria de l'informaçion a fornisce unna monæa universale pe-o confronto de metabòlomi particolæ e a previxon de teorie da defeisa de preuve.
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©2021 Assoçiaçion americaña pe-o progresso da sciensa. tutti i driti reservai. AAAS o l'é un compagno de HINARI, AGORA, OARE, CÒRO, ORLOGISS, Referimenti incroxæ e CONTATÔ. I progresci da sciensa ISSN 2375-2548.