L’articolo o fa parte de l’argomento de reçerca “Megioâ a rescistensa de legumi a-i agenti patògeni e a-i parasciti”, vedde tutti i 5 articoli
L’agente casuale da necròxi da mouttia de ciante da-o fonzo (Lib.) de Bary o deuvia unna strategia à ciù livelli pe infettâ de ciante òspite despæge. Sto studio o propoñe l’utilizzaçion da diamina L-ornitiña, un aminoaçido no proteico ch’o stimola a scintexi d’atri aminoaçidi essençiæ, comme strategia de gestion alternativa pe megioâ e respòste molecolare, fixològiche e biochimiche de Phaseolus vulgaris L. a-o moggio gianco provocou da-o Pseuotidoler. Di esperimenti in vitro an demostrou che a L-ornitiña a l’inibiva de forma scignificativa a crescita miçeliale de S. pyrenoidosa à unna mainea ch’a depende da-a dòse. In azzonta, o porrieiva redue scignificativamente a gravitæ do moggio gianco inte condiçioin de særa. Pe de ciù, a L-ornitiña a l’à stimolou a crescita de ciante trattæ, cösa ch’a l’indica che e conçentraçioin testæ de L-ornitiña no ean fitotòsciche pe-e ciante trattæ. Pe de ciù, a L-ornitiña a l’à aumentou l’esprescion d’antioscidanti no enzimatichi (fenòlichi e flavonòidi solubili totali) e d’antioscidanti enzimatichi (catalaxi (CAT), peroscidaxi (POX) e polifenöli oscidaxi (PPO)) e a l’à accresciuo l’esprescion de trei geni ligæ à l’antioscidante (PVD, PvD1). Pe de ciù, l’analixi in silico a l’à revelou a presensa de unna proteiña putativa d’ossaloaçetato d’açetilidròlaxi (SsOAH) into genöma de S. sclerotiorum, ch’a s’assumeggia ben ben a-e proteiñe d’ossaloaçetato d’açetilidròlaxi (SsOAH) de Aspergillus. (PlOAH) in termini d’analixi fonçionale, dominni conservæ e topologia. Curiosamente, l’azzonta de L-ornitiña a-o mezzo de broddo de destròsa de patatte (PDB) a l’à reduto scignificativamente l’esprescion do gene SsOAH inti miçeli de S. sclerotiorum. Do mæximo, l’applicaçion esogenica de L-ornitiña a l’à reduto scignificativamente l’esprescion do gene SsOAH inte miçelie fonziche recuggeite da-e ciante trattæ. Pe finî, l’applicaçion de L-ornitiña a l’à reduto scignificativamente a secreçion d’açido ossalico tanto into mezzo PDB comme inte feugge infetæ. Pe finî, a L-ornitiña a zeuga un ròllo primmäio into mantegnî o stato redox e into megioâ a respòsta de defeisa de ciante infette. I exiti de sto studio peuan aggiuttâ à sviluppâ di metodi innovativi e respettoxi de l’ambiente pe controllâ a moffa gianca e ammermâ o seu impatto in sciâ produçion de faxeu e in scê atre cortue.
A moffa gianca, provocâ da-o fongo necròtròfico de Bary, a l’é unna mouttia devastante ch’a redue a reisa e ch’a rappresenta unna menassa grave pe-a produçion globale de faxeu (Bolton et al., 2006). A sclerotinia sclerotiorum a l’é un di agenti patògeni de ciante ciù diffiçili da controllâ, con unna larga gamma d’òspiti de ciù de 600 speçie de ciante e a capaçitæ de maçerâ a-a spedia i tesciui òspiti à unna mainea no speçifica (Liang e Rollins, 2018). Inte condiçioin desfavorevole, o patisce unna fase critica do seu çiclo de vitta, e o l’arresta dormiente pe di longhi periodi de tempo comme de struttue neigre, due, che s’assumeggian à de semense dite «sclerotia» into terren ò comme de crescitue gianche e peluche into miçelio ò into stemma de ciante infette (alwart et20.5.0). S. sclerotiorum o peu formâ de sclerötie, cösa ch’a ghe permette de vive inti campi infetæ pe di longhi periodi de tempo e de persciste durante a mouttia (Schwartz et al., 2005). I scleröti en ricchi de nutrienti, peuan persciste into terren pe di longhi periodi e fonçioñan comme inocolo primmäio pe-e infeçioin che vëgnan apreuvo (Schwartz et al., 2005). Inte condiçioin favorevole, i scleröti germinan e produxan de spöre inte l’äia che peuan infettâ tutte e parte da cianta in sciô terren, compreiso ma no limitæ à quelle de scioî, de gamba ò de baccelle (Schwartz et al., 2005).
A sclerotinia a deuvia unna strategia à ciù livelli pe infettâ e seu ciante òspite, ch’a l’à da fâ con unna serie d’eventi coordinæ da-a germinaçion scleròçiale a-o sviluppo di scintomi. A-o comenso, S. sclerotiorum o produxe de spöre in sospenscion (dite ascospöre) da de struttue che s’assumeggian à di fonzi dite apoteçia, che vëgnan trasportæ inte l’äia e se sviluppan inte de sclerötie no mòbile in scî detriti de ciante infetæ (Bolton et al., 2006). Dapeu o fonzo o secrete l’açido ossalico, un fattô de virulensa, pe controllâ o pH da miagia de çellole de ciante, promeuve a degraddaçion enzimatica e l’invaxon di tesciui (Hegedus e Rimmer, 2005) e sopprimme l’esploxon oscidativa da cianta òspite. Sto proçesso d’açidificaçion o l’indebolisce a miagia de çellole de ciante, co-o fornî un ambiente favorevole pe-o fonçionamento normale e effiçente di enzimi che degraddan a miagia de çellole di fonzi (CWDE), permettendo a-o patògeno de scompassâ a barriera fixica e de penetrâ inti tesciui òspiti (Marciano et al., 1983). Unna vòtta penetrou, S. sclerotiorum o secreta unna çerta quantitæ de CWDE, comme a poligalatturonaxi e a çellolaxi, che rendan ciù façile a seu diffuxon inti tesciui infetæ e pròvocan a necròxi di tesciui. A progrescion de lexoin e de tappetin d’ifa a pòrta a-i scintomi caratteristichi da moffa gianca (Hegedus e Rimmer, 2005). Into mentre, e ciante òspite reconoscian i modelli molecolari assoçiæ a-i patògeni (PAMP) pe mezo di reçettoî de reconoscimento di modelli (PRR), provocando unna serie d’eventi de segnalaçion che in sciâ fin attivan de respòste de defeisa.
Sciben che gh’é stæto de dëxeñe d’anni de sfòrsci pe-o contròllo de mouttie, a mancansa de germoplasma rescistente adeguou a l’arresta inti faxioli, comme inte atre cortue commerciale, apreuvo a-a rexistensa, a-a sopravivensa e a-a capaçitæ d’adattamento do patògeno. A gestion de moutie a l'é donca un muggio diffiçile e a domanda unna strategia intregâ e à tante parte ch'a comprende unna combinaçion de prattiche colturale, contròllo biològico e fonziçidi chimichi (O'Sullivan et al., 2021). O contròllo chimico da moffa gianca o l’é o ciù efficaçe perché i fonziçidi, quande vëgnan applicæ correttamente e into momento giusto, peuan controllâ effettivamente a diffuxon da mouttia, redue a gravitæ de l’infeçion e redue a-o minimo e perdie de reisa. À tutti i mòddi, l’utilizzaçion eccesciva e a dependensa eccesciva da-i fonziçidi peuan portâ à l’emerscion de çeppi rescistenti de S. sclerotiorum e avei un effetto negativo in scî organismi no bersalio, in sciâ sanitæ do seu e in sciâ qualitæ de l’ægua (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Donca, attrovâ de alternative respettose de l'ambiente o l'é vegnuo à ëse unna prioritæ mascima.
E poliamiñe (PA), comme a putresciña, a spermidiña, a spermina e a cadaveriña, peuan servî da alternative prometteuse contra i agenti patògeni de ciante trasportæ da-o seu, reduxendo coscì do tutto ò in parte l’utilizzaçion de fonziçidi chimichi reisegoxi (Nehela et al., 2024; Yi20 et al., 2). Inte ciante ciù erte, i PA piggian parte à tanti proçesci fisiològichi, compreiso, ma no limitæ à, a divixon de çellole, a differençiaçion e a respòsta a-i stress abiòtichi e biòtichi (Killiny e Nehela, 2020). Peuan fonçionâ comme antioscidanti, aggiuttâ à scassâ e speçie d’oscigeno reattivo (ROS), mantegnî l’omeostaxi redox (Nehela e Killiny, 2023), indue di geni ligæ a-a defeisa (Romero et al., 2018), regolâ diversci percorsci metabòlichi (Nehela e Killiny3). Killiny, 2019), stabiliscian a rexistensa scistemica aquixia (SAR) e regolan e interaçioin ciante-patògeni (Nehela e Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). Va dito che i meccanismi e i ròlli speçifichi de PA inta defeisa de ciante cangian à segonda da speçie de ciante, di agenti patògeni e de condiçioin de l’ambiente. A PA ciù abbondante inte ciante a ven bioscintetizzâ da-a poliamina L-ornitiña essençiale (Killiny e Nehela, 2020).
A L-ornitiña a zeuga diversci ròlli inta crescita e into sviluppo de ciante. Pe dâ un exempio, di studdi preçedenti an mostrou che into riso (Oryza sativa), l’ornitiña a peu ëse assoçiâ a-o reçiclaggio de l’azöto (Liu et al., 2018), a-a reisa do riso, a-a qualitæ e à l’aroma (Lu et al., 2020) e a-a respòsta a-o stress idrico (Yang et al., 2000). Pe de ciù, l’applicaçion esogena de L-ornitiña a l’à aumentou scignificativamente a tolleransa a-a seçia inta barbabietola da succao (Beta vulgaris) e a l’à ammermou o stress pe-a sâ inta çioula (Allium Cepa) Rocha e atri, 2012). O ròllo potensiale da L-ornitiña inta defeisa contra o stress abiòtico o peu ëse dovuo a-o seu coinvolzimento inte l’accumulo de proliña inte ciante trattæ. Comme exempio, l’é stæto decciarou in preçedensa che di geni ligæ a-o metabolismo da proliña, comme i geni de l’aminotrasferaxi delta de l’ornitiña (delta-OAT) e da proliña deidrogenaxi (ProDH1 e ProDH2), en stæti decciaræ in preçedensa comme ligæ a-a defeisa da bentamina da nicotiana e da arabidopsis taliaña contra e pse no òspite. Misô, 2012). D’atro canto, a decarboscilaxi ornitiña fonzica (ODC) a l’é neçessäia pe-a crescita do patògeno (Singh et al., 2020). Mirâ l’ODC do fusario oscispöro f. sp. licoperscici pe mezo do scilensiamento genico induto da l’òspite (HIGS) an aumentou de forma scignificativa a rexistensa de ciante de tomata a-o marcimento de Fusarium (Singh et al., 2020). À tutti i mòddi, o ròllo potensiale de l’applicaçion d’ornitiña esogenica contra di stress biòtichi comme i fitopatogeni o no l’é stæto ben studiou. De ancon ciù importansa, i effetti de l’ornitiña in sciâ rexistensa a-e mouttie e in scî fenòmeni biochimichi e fisiològichi ligæ arrestan pe-a ciù parte inesploræ.
A comprenscion da complescitæ de l’infeçion da S. sclerotiorum de leguminose a l’é importante pe-o sviluppo de strategie de contròllo efficaçe. Inte sto studio emmo vosciuo identificâ o ròllo potençiale da diamina L-ornitiña comme fattô ciave pe megioâ i meccanismi de defeisa e a rexistensa de ciante de leguminose à l’infeçion da Sclerotinia sclerotiorum. Ipotizzemmo che, ciù in là do megioamento de respòste de defeisa de ciante infette, a L-ornitiña a zeuge ascì un ròllo primmäio into mantegnî o stato redox. Proponemmo che i effetti potensiali da L-ornitiña seggian ligæ a-a regolaçion di meccanismi de defeisa antioscidante enzimatichi e no enzimatichi e à l’interferensa co-i fattoî de patogeniçitæ/virulensa di fonzi e e proteiñe assoçiæ. Sta doggia fonçionalitæ da L-ornitiña a ô rende un candidato promettendo pe unna strategia sostegnibile pe ammermâ l’impatto da moffa gianca e megioâ a rexistensa de cortue de leguminose commun à sto potente patògeno fonzico. I exiti do presente studio peuan aggiuttâ a-o sviluppo de metodi innovativi e respettoxi de l’ambiente pe controllâ a moffa gianca e ammermâ o seu impatto in sciâ produçion de leguminose.
Inte sto studdio, unna varietæ commersâ suscettibile de faxeu commun, Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3), a l'é stæta deuviâ comme mateiâ sperimentâ. E semense sane en stæte fornie con bontæ da-o departamento de reçerca in scê legumi, de l’Instituto de reçerca in scê cortue de campo (FCRI), do Çentro de reçerca agricola (ARC), in Egitto. Çinque semense en stæte semenâ inte di vaxi de plastica (diametro interno 35 cm, profonditæ 50 cm) impii de tæra infetta da S. sclerotiorum inte condiçioin de særa (25 ± 2 °C, umiditæ relativa 75 ± 1%, 8 h luxe/16 h scui). À 7-10 giorni dòppo a semensa (DPS), e ciante en stæte ascciæie pe lasciâ solo doe ciante con unna crescita uniforme e træ feugge completamente allargæ inte ògni vaso. Tutte e ciante inte di vaxi vegnivan annagæ unna vòtta ògni doe settemañe e fecondæ tutti i meixi a-o tasso recommandou pe-a varietæ dæta.
Pe preparâ unna conçentraçion de 500 mg/L de L-ornitinediamina (conosciua ascì comme açido (+)-(S)-2,5-diaminopentanòico; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germania), 50 mg en stæti deslenguæ pe-a primma vòtta inte 100 mL d’ægua distillâ sterile. Dapeu a soluçion de stock a l’é stæta diluia e deuviâ inti esperimenti vegnui apreuvo. In curta, sëi serie de conçentraçioin de L-ornitiña (12,5, 25, 50, 75, 100 e 125 mg/L) en stæte verificæ in vitro. Pe de ciù, l'ægua distillâ sterile a l'é stæta addeuviâ comme contròllo negativo (Mock) e o fonziçida commerciale “Rizolex-T” 50% de pövea umidabile (toclofos-metil 20% + tiram 30%; comme contròllo poxitivo. O fonziçida commerciale «Rizolex-T» o l’é stæto testou in vitro à çinque conçentraçioin (2, 4, 6, 8 e 10 mg/L).
Di campioin de gamba e de baccelle de faxeu commun che mostravan di scintomi tipichi de moffa gianca (tascio d'infestaçion: 10-30%) son stæti arrecuggeiti da-e fattoie commerciale. Sciben che a ciù parte di materiali de ciante infetæ en stæti identificæ pe speçie/varietæ (varietæ commerciale suscettibile Giza 3), di atri, mascime quelli ottegnui da-i mercoei do pòsto, ean de speçie desconosciue. I materiali infetæ arrecuggeiti en stæti primma desinfetæ in sciâ superfiçie con unna soluçion d'ipoclorito de sòdio a-o 0.5% pe 3 menuti, dapeu sciaccæ ciù vòtte con de l'ægua distillâ sterile e asciugæ à secco con do papê de filtro sterile pe remeuve l'ægua in eccesso. Dapeu i òrgani infetæ en stæti taggiæ à tòcchi piccin da-o tesciuo de mezo (tra tesciui sani e infetæ), cortivæ in sce un mezzo d’agar de destrosa de patatte (PDA) e incubæ à 25 ± 2 °C con un çiclo de 12 h de luxe/12 h de scuo pe 5 giorni pe stimolâ a formaçion da sclerotia. O metodo da ponta miçeliale o l’é stæto deuviou ascì pe purificâ di fonzi isoæ da de coltue mescce ò contaminæ. L’isolou de fonzi purificou o l’é stæto identificou pe-a primma vòtta in sciâ base de seu caratteristiche morfològiche colturale e dapeu o l’é stæto confermou comme S. sclerotiorum in sciâ base de caratteristiche microscòpiche. Pe finî, tutti i isoæ purificæ en stæti verificæ pe-a patogeniçitæ in sciâ cortivaçion de faxeu commun suscettile Giza 3 pe satisfâ i pòstulæ de Koch.
Pe de ciù, l’isolou de S. sclerotiorum ciù invasivo (isolou n.3) o l’é stæto confermou ancon de ciù in sciâ base do sequensiamento do spaçiatô trascrito interno (ITS), comme descrito da White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. In curta, i isoæ en stæti cortivæ inte un broddo de destròsa de patatte (PDB) e incubæ à 25 ± 2 °C pe 5-7 giorni. Dapeu o miçelio di fonzi o l’é stæto recuggeito, filtrou pe mezo da stöfa de formaggio, lavou doe vòtte con de l’ægua sterile e asciugou con do papê de filtro sterile. O DNA genòmico o l’é stæto isolou pe mezo do kit de miniprep pe fonzi e battëi Quick-DNATM. Dapeu a region do rDNA ITS a l’é stæta amplificâ pe mezo da cobbia speçifica de primer ITS1/ITS4. I produti PCR purificæ en stæti sottomissi pe-o sequensiamento. E sequense de rDNA ITS en stæte sequensiæ bidireçionalmente pe mezo do metodo de sequensiamento de Sanger. Dapeu e sequense de query assemblæ en stæte confrontæ co-i urtimi dæti da GenBank e do Çentro naçionale pe l’informaçion in scê biotecnologie (NCBI) pe mezo do software BLASTn. A sequensa de query a l’é stæta confrontâ con 20 atri çeppi/isoæ de S. sclerotiorum repiggiæ da-i urtimi dæti inta GenBank NCBI (tabella S1 in azzonta) pe mezo de ClustalW into pacchetto d’analixi genetica evolutiva molecolare (MEGA-11; verscion 11) (Kumar et al., 20). L’analixi evolutiva a l’é stæta fæta pe mezo do metodo da mascima probabilitæ e o modello generale de sostituçion di nucleotidi reverscibili into tempo (Nei e Kumar, 2000). Se mostra l’erbo co-a probabilitæ de log ciù erta. L’erbo de comenso pe-a reçerca euristica o vëgne seleçionou co-a çernia de l’erbo co-a probabilitæ de log ciù erta tra l’erbo de l’union vexiña (NJ) e l’erbo da parscimonia mascima (MP). L’erbo NJ o l’é stæto construto pe mezo de unna matrixe de distanse in cobbia carcolâ pe mezo do modello generale reverscibile into tempo (Nei e Kumar, 2000).
L’attivitæ antibattëia da L-ornitiña e do batteriçida «Rizolex-T» a l’é stæta determinâ in vitro co-o metodo de diffuxon d’agar. Metodo: Piggiâ a quantitæ appropriâ da soluçion de stock de L-ornitiña (500 mg/L) e mescciâla ben ben con 10 ml do mezzo nutriente PDA pe preparâ de soluçioin con de conçentraçioin finale de 12,5, 25, 50, 75, 100 e 125 mg/L, rispettivamente. Comme contròllo l’é stæto deuviou çinque conçentraçioin do fonziçida “Rizolex-T” (2, 4, 6, 8 e 10 mg/L) e d’ægua distillâ sterile. Dòppo che o mezzo o s’ea solidificou, un tappo miçeliale preparou da neuva da coltua de Sclerotinia sclerotiorum, de diametro 4 mm, o l’é stæto trasferio a-o çentro do vassoio de Petri e cortivou à 25±2°C fin à quande o miçelio o l’à creuvio tutto o vassoio de Petri de contròllo, dòppo o quæ l’é stæto registrou a crescita di fonzi. Carcolâ l’inibiçion perçentuale da crescita radiale de S. sclerotiorum pe mezo de l’equaçion 1:
L'esperimento o l'é stæto repetio doe vòtte, con sëi replici biològichi pe ògni gruppo contròllo/sperimentale e çinque vaxi (doe ciante pe vaso) pe ògni replic biològico. Ògni replicâ biològico o l’é stæto analizzou doe vòtte (doî replici tecnichi) pe garantî a preçixon, l’affidabilitæ e a reproduçibilitæ di exiti sperimentali. Pe de ciù, l’analixi de regrescion probita a l’é stæta addeuviâ pe carcolâ a conçentraçion inibitoa meza mascima (IC50) e IC99 (Prentice, 1976).
Pe valuâ o potençiale da L-ornitiña inte condiçioin de særa, l’é stæto fæto doî esperimenti consecutivi in ​​vaso. In curta, i vaxi en stæti impii con do terren de tæra rossa-æña sterilizzæ (3:1) e inocolæ con unna coltua de S. sclerotiorum preparâ da neuva. Pe primma cösa, l’isolou ciù invasivo de S. sclerotiorum (isolou n.3) o l’é stæto cortivou co-o taggiâ un sclerotio à meitæ, co-o mettelo co-a faccia in zu in sce un PDA e co-o incubâlo à 25°C inte un sciuo costante (24 oe) pe 4 giorni pe stimolâ a crescita do miçelio. Dapeu en stæti piggiæ quattro tappi d’agar de diametro 5 mm da-o bordo de fronte e inocolæ con 100 g de unna mescciua sterile de gran e crun de riso (1:1, v/v) e tutti i pallon en stæti incubæ à 25 ± 2 °C sotta un çiclo de 12 h de luxe/12 h de scuo pe stimolâ a formaçion scotia pe 5. I contegnui de tutti i contegnitoî vegnivan ben ben mescciæ pe garantî l'omogeneitæ avanti d'azzonze do terren. Dapeu, 100 g da mescciua de bran colonizzante en stæti azzonti à ògni cazzetta pe garantî unna conçentraçion costante de agenti patògeni. I vaxi inocolæ vegnivan annagæ pe attivâ a crescita di fonzi e missi inte de condiçioin de særa pe 7 giorni.
Çinque semense da varietæ Giza 3 son stæte donca semenâ inte ògni vaso. Pe-e vasche trattæ con L-ornitiña e o fonziçida Rizolex-T, e semense sterilizzæ en stæte primma impremuæ pe doe oe inte unna soluçion aquosa di doî compòsti con unna conçentraçion finale de IC99 de 250 mg/L pöcassæ e 50 mg/L, rispettivamente, e dapeu vëgnan sciugæ à l’äia pe unn’oa. D’atro canto, e semense vegnivan impremuæ inte de l’ægua distillâ sterile comme contròllo negativo. Dòppo 10 giorni, avanti da primma annaggio, e ciante vegnivan ascciæie, con lasciâ solo doe ciante nette inte ògni cazzetta. Pe de ciù, pe garantî l’infeçion con S. sclerotiorum, e gamba de ciante de faxeu into mæximo stadio de sviluppo (10 giorni) en stæte taggiæ inte doe localitæ despæge pe mezo de un bisturio sterilizzou e 0.5 g pöcassæ da mescciua de bran colonizzante en stæti missi inte tutte e ferie, e dapeu l’é stæto misso unn’erta umiditæ pe sviluppâ tutte e mouttie. E ciante de contròllo en stæte ferie à un mòddo pægio e unna quantitæ pægia (0.5 g) de mescciua de bran sterile e no colonizzâ a l’é stæta missa inta feria e mantegnua sotta unn’erta umiditæ pe scimolâ l’ambiente pe-o sviluppo da mouttia e garantî a coerensa tra i gruppi de trattamento.
Metodo de trattamento: e ciante de faxeu vegnivan sciortie con 500 ml de unna soluçion aquosa de L-ornitiña (250 mg/l) ò do fonziçida Rizolex-T (50 mg/l) con irrigâ o terren, dapeu o trattamento o vegniva repetio træ vòtte à un intervallo de 10 giorni. I contròlli trattæ con placebo son stæti irrigæ con 500 ml d'ægua distillâ sterile. Tutti i trattamenti en stæti fæti inte condiçioin de særa (25 ± 2°C, 75 ± 1% d'umiditæ relativa e un fotoperiodo de 8 h luxe/16 h scuo). Tutti i vaxi vegnivan annagæ tutte e quinze giorni e trattæ tutti i meixi con un fertilizzante NPK equilibrou (20-20-20, co-o 3,6% de sorfo e microelementi TE; Zain Seeds, Egitto) à unna conçentraçion de 3-4 g/l con spray in scê feugge segondo e recommandaçioin pe-a varietæ speçifica do produttô. Delongo che no segge dito à unn’atra mainea, e feugge meiue completamente espanse (2° e 3° feuggie da-o d’ato) en stæte recuggeite da ògni replicâ biològico à 72 oe dòppo o trattamento (hpt), omogeneizzæ, misse insemme e conservæ à -80 °C pe de atre analixi, compreiso, ma no limitæ à, l’indicaçion per-oscidâ in situ, l’istochimica. e antioscidanti no enzimatichi e esprescion genica.
L’intensitæ de l’infeçion da moffa gianca a l’é stæta valuâ tutte e settemañe 21 giorni dòppo l’inocolaçion (dpi) pe mezo de unna scâ da-o 1 a-o 9 (tabella S2 in azzonta) basâ in sciâ scâ de Petzoldt e Dickson (1996) modificâ da Teran et al. (2006). In curta, e gamba e e ramme de ciante de faxeu en stæte examminæ à partî da-o ponto d’inocolaçion pe anâ apreuvo a-a progrescion de lexoin longo di internòdi e di nòdi. Dapeu l’é stæto mesuou a distansa da lexon da-o ponto d’inocolaçion a-o ponto ciù lontan longo o stemma ò a ramma e l’é stæto assegnou un pontuaçion de 1-9 in sciâ base da poxiçion da lexon, donde (1) o no l’indicava nisciuña infeçion vixibile vexin a-o ponto d’inocolaçion e (2-9) o l’indicava un aumento gradduale da dimenscion da lexon a/S). Dapeu l’intensitæ de l’infeçion da moffa gianca a l’é stæta convertia in perçentuale pe mezo da formola 2:
Pe de ciù, l’area sotta a curva de progrescion da mouttia (AUDPC) a l’é stæta carcolâ pe mezo da formola (Shaner e Finney, 1977), ch’a l’é stæta adattâ de fresco pe-a putrefaçion gianca do faxeu commun (Chauhan et al., 2020) pe mezo de l’equaçion 3:
Donde Yi = gravitæ da moutia a-o momento ti, Yi+1 = gravitæ da moutia a-o momento proscimo ti+1, ti = tempo da primma mesuaçion (in giorni), ti+1 = tempo da mesuaçion apreuvo (in giorni), n = numero totale de ponti de tempo ò ponti d'osservaçion. I parametri da crescita de ciante de faxeu, compreiso l’ertessa de ciante (cm), o numero de ramme pe cianta e o numero de feugge pe cianta en stæti registræ tutte e settemañe pe 21 giorni inte tutti i replici biològichi.
Inte ògni replicâ biològico, i campioin de feugge (segonde e terse feugge sviluppæ do tutto da-o ciù in çimma) en stæti recuggeiti a-o giorno 45 dòppo o trattamento (15 giorni dòppo l’urtimo trattamento). Ògni replicâ biològico o conscisteiva inte çinque vasche (doe ciante pe vaso). 500 mg pöcassæ do tesciuo tritou en stæti deuviæ pe l’estraçion de pigmenti fotoscintetichi (clorofilla a, clorofilla b e carotenòidi) pe mezo de l’açetöna à l’80% à 4 °C a-o sciuo. Dòppo 24 oe, i campioin son stæti çentrifugæ e o sorvenatante o l'é stæto recuggeito pe-a determinaçion do contegnuo de clorofilla a, clorofilla b e carotenòidi pe mezo de un spettrofotòmetro UV-160A (Shimadzu Corporation, Giappon) segondo o metodo de longhixe d’onda (A470, A646 e A663 nm). Pe finî, o contegnuo di pigmenti fotoscintetichi o l’é stæto carcolou pe mezo de formole 4-6 descrite da Lichtenthaler (1987).
À 72 h dòppo o trattamento (hpt), e feugge (segonde e terse feugge sviluppæ do tutto da-o ciù in çimma) en stæte recuggeite da ògni replicâ biològico pe-a localizzaçion istochimica in situ do peròscido d’idrògeno (H2O2) e de l’anion superòscido (O2•−). Ògni replicâ biològico o conscisteiva inte çinque vasche (doe ciante pe vaso). Ògni replic biològico o l’é stæto analizzou in duplice (doî replici tecnichi) pe garantî a preçixon, l’affidabilitæ e a reproduçibilitæ do metodo. H2O2 e O2•− en stæti determinæ pe mezo do 0.1% de 3,3′-diaminobenzidiña (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germania) ò do tetrazòlio nitrobleu (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germania) rispettivamente, segondo i metodi descriti da Romero et al. (2004) e o Adam e i atri. (1989) con de modifiche ciù picciñe. Pe-a localizzaçion istochimica de H2O2 in situ, i feuggiæ en stæti infiltræ à veuo co-o 0.1% de DAB inte un tampon Tris 10 mM (pH 7.8) e dapeu en stæti incubæ à temperatua ambiente a-a luxe pe 60 menuti. I feuggiæ en stæti sbiancæ into 0.15% (v/v) de TCA inte l’etanölo:cloroformo 4:1 (v/v) (Farmaçeutichi e fornitue mediche Al-Gomhoria, Cairo, Egitto) e dapeu espòsti a-a luxe fin à quande no son vegnui scui. Do mæximo, e valvole en stæte infiltræ à veuo con un tampon de fosfato de potassio 10 mM (pH 7,8) ch’o contegniva 0,1 w/v % de HBT pe-a localizzaçion istochimica de O2•− in situ. I feuggiæ en stæti incubæ inta luxe à temperatua ambiente pe 20 menuti, dapeu sbiancæ comme de d’ato e dapeu inluminæ fin à quande no l’é compario di macchi bleu scui/violetti. L'intensitæ do cô brun (comme indicatô de H2O2) ò bleu-violetto (comme indicatô de O2•−) ch'o ne sciòrte a l'é stæta valuâ deuviando a verscion Fiji do pacchetto d'elaboraçion de l'imagine ImageJ (http://fiji.sc; consultou a-i 7 de marzo do 2024).
O malondialdeide (MDA; comme marcatô de peroscidaçion di lipidi) o l’é stæto determinou segondo o metodo de Du e Bramlage (1992) con de modifiche picciñe. E feugge de tutti i replicæ biològichi (segonde e terse feugge sviluppæ do tutto da-o ciù in çimma) en stæte recuggeite 72 oe dòppo o trattamento (hpt). Ògni replicâ biològico o comprendeiva çinque vaxi (doe ciante pe vaso). Ògni replic biològico o l’é stæto analizzou in duplice (doî replici tecnichi) pe garantî a preçixon, l’affidabilitæ e a reproduçibilitæ do metodo. In curta, 0.5 g de tesciuo de feuggie mòlle en stæti deuviæ pe l’estraçion de MDA con de l’açido tricloroaçetico a-o 20% (TCA; Dapeu o contegnuo de MDA into sorvenatante o l’é stæto determinou colorimetricamente mesuando a sciorbensa à 532 e 600 nm pe mezo de un spettrofotòmetro UV-160A (Shimadzu Corporation, Giappon) e dapeu espresso comme nmol g-1 FW.
Pe-a valutaçion di antioscidanti no enzimatichi e enzimatichi, e feugge (segonde e terse feugge sviluppæ do tutto da-o ciù in çimma) en stæte recuggeite da ògni replicâ biològico à 72 h dòppo o trattamento (hpt). Ògni replicâ biològico o conscisteiva inte çinque vasche (doe ciante pe vaso). Ògni campion biològico o l'é stæto analizzou in duplice (doî campioin tecnichi). Doe feugge en stæte mòlle con de l’azöto liquido e deuviæ direttamente pe-a determinaçion di antioscidanti enzimatichi e no enzimatichi, di aminoaçidi totali, do contegnuo de proliña, de l’esprescion genica e da quantificaçion de l’ossalato.
I fenòlichi solubili totali en stæti determinæ pe mezo do reagente Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich, St. (1999). In curta, 0.1 g pöcassæ de tesciuo de feugge omogeneizzou o l’é stæto estræto con 20 ml de metanölo à l’80% a-o sciuo pe 24 oe e o sorvenatante o l’é stæto recuggeito dòppo a centrifugaçion. 0,1 ml de l'estratto do campion o l'é stæto mescciou con 0,5 ml de reagente Folin-Ciocalteu (10%), agitou pe 30 s e lasciou a-o sciuo pe 5 menuti. Dapeu 0.5 ml de soluçion de carbonato de sòdio a-o 20% (Na2CO3; Soçietæ de fornitue farmaçeutiche e mediche Al-Gomhoria, Cairo, Egitto) en stæti azzonti à ògni cannæ, mescciæ ben ben e incubæ à temperatua ambiente a-o sciuo pe 1 h. Dòppo l’incubaçion, a sciorbensa da mescciua de reaçion a l’é stæta mesuâ à 765 nm pe mezo de un spettrofotòmetro UV-160A (Shimadzu Corporation, Giappon). A conçentraçion de fenöli solubili totali inti estratti di campioin a l'é stæta determinâ pe mezo de unna curva de taratua de l'açido gallico (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) e espressa comme milligrammi d'açido gallico equivalente pe grammo de peiso neuvo (mg GAE g-1 peiso neuvo).
O contegnuo totale de flavonòidi solubili o l’é stæto determinou segondo o metodo de Djeridane et al. (2006) con de picciñe modifiche. In curta, 0.3 ml de l’estratto de metanòlo mensunou de d’ato en stæti mescciæ con 0.3 ml de soluçion de cloruro d’alluminio a-o 5% (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, USA), mescciæ con vigor e dapeu incubæ à temperatua ambiente pe 5 menuti, e apreuvo l’azzonta de soluçion de m310 de 0%. (Farmaçeutichi e fornitue mediche Al-Gomhoria, Cairo, Egitto), mescciæ ben ben e incubæ à temperatua ambiente pe 30 menuti a-o sciuo. Dòppo l’incubaçion, a sciorbensa da mescciua de reaçion a l’é stæta mesuâ à 430 nm pe mezo de un spettrofotòmetro UV-160A (Shimadzu Corporation, Giappon). A conçentraçion de flavonòidi solubili totali inti estratti de campioin a l'é stæta determinâ pe mezo de unna curva de taratua da rutiña (TCI America, Portland, OR, USA) e dapeu espressa comme milligrammi d'equivalente de rutiña pe grammo de peiso neuvo (mg RE g-1 peiso neuvo).
O contegnuo totale d’aminoaçidi liberi inte feuggie de faxeu o l’é stæto determinou pe mezo de un reagente de ninidriña modificou (chimiche termo scientifiche, Waltham, Massachusetts, USA) basou in sciô metodo propòsto da Yokoyama e Hiramatsu (2003) e modificou da Sun et al. (2006). In curto, 0,1 g de tesciuo mòllo o l’é stæto estræto con un tampon à pH 5,4 e 200 μL do sorvenatante o l’é stæto reagio con 200 μL de conidriña (2%) e 200 μL de piridiña (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, USA), incubæ inte un mesuou à 580 nm pe mezo de un spettrofotòmetro UV-160A (Soçietæ Shimadzu, Giappon). D’atro canto, a proliña a l’é stæta determinâ da-o metodo de Bates (Bates et al., 1973). A proliña a l’é stæta estræta con de l’açido sorfosaliçilico a-o 3% (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, Massachusetts, USA) e dòppo a centrifugaçion, 0.5 ml do sorvenatante en stæti mescciæ con 1 ml d’açido açetico glaçiale (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) e un reagente de ninidriña co-assuou à 5°C e incu. à 520 nm pe mezo do mæximo spettrofotòmetro de d’ato. I aminoaçidi liberi totali e a proliña inti estratti de feugge en stæti determinæ pe mezo de curve de taratua de gliçiña e proliña (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) rispettivamente e espressi comme mg/g de peiso neuvo.
Pe determinâ l’attivitæ enzimatica di enzimi antioscidanti, 500 mg pöcassæ de tesciuo omogeneizzou en stæti estræti con 3 ml de tampon Tris 50 mM (pH 7,8) ch’o contegniva 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO, USA), çentrifugæ à 10.000 × g pe 20 menuti sotta refrigeraçion (4 °C) e o sorvenatante (estratto gròsso d’enzima) o l’é stæto recuggeito (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Dapeu a catalaxi (CAT) a l’é stæta reagia con 2 ml de tampon de fosfato de sòdio 0,1 M (pH 6,5; Sigma-Aldrich, St. 2023; Osman e atri, 2023). L’attivitæ enzimatica da peroscidaxi dependente da-o guaiacol (POX) a l’é stæta determinâ pe mezo do metodo de Harrach et al. (2009). (2008) con de modifiche ciù picciñe (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) e l’attivitæ enzimatica da polifenölo oscidaxi (PPO) a l’é stæta determinâ dòppo a reaçion con 2,2 ml de tampon de fosfato de sòdio 100 mM (pH de guacol 6,0l). Portland, OR, Stati Unii) e 100 μl de H2O2 12 mM. O metodo o l'é stæto un pittin cangiou da-o (El-Nagar e atri, 2023; Osman e atri, 2023). L'analixi a l'é stæta fæta dòppo a reaçion con 3 ml de soluçion de catecol (0,01 M) preparâ da neuva inte un tampon fosfato 0,1 M (pH 6,0). L’attivitæ CAT a l’é stæta mesuâ monitorando a decompoxiçion de H2O2 à 240 nm (A240), l’attivitæ POX a l’é stæta mesuâ monitorando l’aumento da sciorbensa à 436 nm (A436) e l’attivitæ PPO a l’é stæta mesuâ registrando e fluttuaçioin de sciorbensa à 495 nm ògni min U30 a spettrofotòmetro (Shimadzu, Giappon).
A RT-PCR in tempo reale a l’é stæta deuviâ pe relevâ i livello de trascriçion de trei geni ligæ à l’antioscidante, compreiso a catalaxi peroscisòmica (PvCAT1; n. Açescion n. KY195009.1), inte feuggie de faxeu (a segonda e a tersa feuggie sviluppæ do tutto da-o ciù in çimma) 72 h dòppo l’urtimo trattamento. In curta, l’RNA o l’é stæto isolou pe mezo do kit d’estraçion de l’RNA totale Simply P (n. cat. BSC52S1; BioFlux, tecnologia Biori, Ciña) segondo o protocòllo do produttô. Dapeu, o cDNA o l’é stæto scintetizzou pe mezo do kit de scintexi do cDNA TOP scriptTM segondo e istruçioin do produttô. E sequense de primer di trei geni stæti mensunæ chì de d’ato en elencæ inta tabella S3 in azzonta. PvActiña-3 (numero d’açescion a-a GenBank: XM_068616709.1) a l’é stæta deuviâ comme gene de domestegaçion e l’esprescion genica relativa a l’é stæta carcolâ pe mezo do metodo 2-ΔΔCT (Livak e Schmittgen, 2001). L’é stæto demostrou a stabilitæ de l’actiña sotta stress biòtico (interaçion incompatibile tra e legumi commun e o fongo antracnòxi) e o stress abiòtico (seçia, salinitæ, bassa temperatua) (Borges et al., 2012).
A-o comenso emmo fæto unn’analixi in silico pe tutto o genöma de proteiñe d’ossaloaçetato d’açetilidròlaxi (OAH) inte S. In curta, emmo deuviou OAH de Aspergillus fijiensis CBS 313,89 (AfOAH; tascide: 1191702; numero d’açescion da GenBank XP_040799428,1; 342 aminoaçidi) e Penicillium lagena (PlOAH2; tascide1Bank: 9). XP_056833920,1; 316 aminoaçidi) comme sequense de query pe mappâ a proteiña omòloga inte S. sclerotiorum (tascido: 5180). BLASTp o l’é stæto fæto contra i dæti do genöma de S. sclerotiorum disponibili ciù de reçente inta GenBank in sciô scito web do Çentro naçionale pe l’informaçion in scê biotecnologie (NCBI).
Pe de ciù, o gene OAH previsto da S. sclerotiorum (SsOAH) e l’analixi evolutiva e l’erbo filogenetico de AfOAH da A. fijiensis CBS 313.89 e PlOAH da P. modello (Jones e atri, 1992). L’erbo filogenetico o l’é stæto combinou con l’analixi d’allineamento multiplo de sequense de proteiñe de tutti i geni OAH previsti (SsOAH) da S. sclerotiorum e a sequensa de query pe mezo do strumento d’allineamento basou in scî vincoli (COBALT; e Agarwala, 2007). Pe de ciù, e sequense d’aminoaçidi correspondenti megio de SsOAH de S. sclerotiorum en stæte allinæ co-e sequense de query (AfOAH e PlOAH) (Larkin et al., 2007) pe mezo de ClustalW. Strumento ESPript (verscion 3.0;
Pe de ciù, i dominni representativi fonçionali previsti e i sciti conservæ de SsOAH de S. sclerotiorum en stæti clascificæ de forma interattiva inte de famigge despæge pe mezo do strumento InterPro (Blum et al., 2021). Pe finî, a modellaçion da struttua tridimenscionale (3D) do SsOAH previsto de S. sclerotiorum a l’é stæta fæta pe mezo do motô de reconoscimento d’omologia/analogia de proteiñe (verscion 2.0 do server Phyre2; 2015) e validæ pe mezo do server SWISS-MODEL (Biasini e atri, 2014). E struttue à træ dimenscioin previste (formato PDB) en stæte vixionæ de forma interattiva pe mezo do pacchetto UCSF-Chimera (verscion 1.15; chimera) (Pettersen et al., 2004).
A PCR quantitativa à fluorescensa in tempo reale a l’é stæta deuviâ pe determinâ o livello de trascriçion de l’ossaloaçetato açetilidròlaxi (SsOAH; numero d’açescion da GenBank: XM_001590428.1) inti miçeli da sclerotinia. In curta, S. sclerotiorum o l’é stæto inocolou inte un contegnitô ch’o contegniva PDB e o l’é stæto misso inte un incubatô à agitâ (modello: I2400, New Brunswick Scientific Co. Dòppo, e çellole en stæte trattæ con L-ornitiña e o fonziçida Rizolex-T à de conçentraçioin finale de IC50 (40 e 3,2 mg/L pöcassæ) e dapeu en stæte cortivæ pe atre 24 oe inte mæxime condiçioin. Dòppo l’incubaçion, e coltue en stæte centrifugæ à 2500 rpm pe 5 menuti e o sorvenatante (miçelio fonzico) o l’é stæto recuggeito pe l’analixi de l’esprescion genica. Do mæximo, o miçelio di fonzi o l’é stæto recuggeito à 0, 24, 48, 72, 96 e 120 h dòppo l’infeçion da de ciante infetæ ch’aivan formou do moggio gianco e do miçelio de coton in sciâ superfiçie di tesciui infetæ. L’RNA o l’é stæto estræto da-o miçelio do fonzo e dapeu o cDNA o l’é stæto scintetizzou comme descrito chì de d’ato. E sequense de primer pe SsOAH en elencæ inta tabella S3 in azzonta. SsActiña (numero d’açescion a-a banca genica: XM_001589919.1) a l’é stæta deuviâ comme gene de domestegaçion e l’esprescion genica relativa a l’é stæta carcolâ pe mezo do metodo 2-ΔΔCT (Livak e Schmittgen, 2001).
L’açido ossalico o l’é stæto determinou into broddo de destròsa de patatte (PDB) e inti campioin de ciante che contegnivan o patògeno fonzico Sclerotinia sclerotiorum segondo o metodo de Xu e Zhang (2000) con de modifiche picciñe. In curta, i isoæ de S. sclerotiorum en stæti inocolæ inte di contegnitoî che contegnivan PDB e dapeu en stæti cortivæ inte un incubatô à agitâ (modello I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, New Brunswick Scientific Co., USA) à 150 giri/min à 25 ± 2 °C pe 3-5 giorni de cortivaçion constante. Dòppo l’incubaçion, a coltua di fonzi a l’é stæta filtrâ primma pe mezo do papê de filtro Whatman #1 e dapeu centrifuga à 2500 rpm pe 5 menuti pe remeuve o miçelio ch’o l’arrestava. O sorvenatante o l’é stæto recuggeito e conservou à 4°C pe unn’atra determinaçion quantitativa de l’ossalato. Pe-a preparaçion di campioin de ciante, 0.1 g pöcassæ de frammenti de tesciuo de ciante en stæti estræti træ vòtte con de l’ægua distillâ (2 ml tutte e vòtte). I campioin son stæti donca centrifugæ à 2500 giri/min pe 5 menuti, o sorvenatante o l'é stæto filtrou à secco pe mezo do papê de filtro Whatman n. 1 e recuggeito pe unn'atra analixi.
Pe l'analixi quantitativa de l'açido ossalico, a mescciua de reaçion a l'é stæta inandiâ inte un cannæo co-o fermo de veddro inte l'ordine chì apreuvo: 0,2 ml de campion (ò filtrou de coltua PDB ò soluçion standard d'açido ossalico), 0,11 ml de bleu bromofenòlico (BPB, 1 mM; açido (H2SO4; Fornitue farmaçeutiche e mediche Al-Gomhoria, Cairo, Egitto) e 0,176 ml de dicromato de potassio à 100 mM (K2Cr2O7; sostanse chimiche TCI, Portland, OR, USA), e dapeu a soluçion a l’é stæta diluia à un pòsto de vigoroso e à 4,8 ml. in sce un bagno d'ægua à 60 °C. Dòppo 10 menuti, a reaçion a l’é stæta fermâ con azzonze 0,5 ml de soluçion d’idròscido de sòdio (NaOH; 0,75 M). A sciorbensa (A600) da mescciua de reaçion a l’é stæta mesuâ à 600 nm pe mezo de un spettrofotòmetro UV-160 (Shimadzu Corporation, Giappon). PDB e ægua distillâ son stæti addeuviæ comme contròlli pe-a quantificaçion di filtræ de coltua e di campioin de ciante rispettivamente. E conçentraçioin d’açido ossalico inti filtræ de coltua, espresse comme microgrammi d’açido ossalico pe millilitro de mezzo PDB (μg.mL-1) e inti estratti de feuggie, espresse comme microgrammi d’açido ossalico pe grammo de peiso neuvo (μg.g-1 FW), en stæte determinæ pe mezo de unna calibraçion de l’açido ossalico curveçente, A calibraçion de l’açido ossalico curve, MA, Stati Unii).
Into corso do studio, tutti i esperimenti en stæti progettæ inte un progetto completamente randomizzou (CRD) con sëi replici biològichi pe trattamento e çinque vaxi pe replici biològichi (doe ciante pe vaso), feua che no segge indicou de mainea despægia. I replici biològichi en stæti analizzæ in duplice (doî replici tecnichi). I replici tecnichi son stæti addeuviæ pe verificâ a reproduçibilitæ do mæximo esperimento, ma no son stæti addeuviæ inte l'analixi statistica pe schivâ di replici fäsci. I dæti son stæti analizzæ statisticamente con deuviâ l'analixi de variansa (ANOVA) e apreuvo o test de differensa onestamente scignificativa (HSD) do Tukey-Kramer (p ≤ 0,05). Pe-i esperimenti in vitro, i valoî de IC50 e IC99 son stæti carcolæ pe mezo do modello probit e l'é stæto carcolou di intervalli de confiansa do 95%.
Inte l’insemme quattro isoæ en stæti arrecuggeiti da diversci campi de söia into governato de El Ghabiya, in Egitto. In sce un mezzo PDA, tutti i isoæ an produto un miçelio gianco cremoso ch’o se fava a-a spedia gianco coton (figua 1A) e dapeu beige ò brun into stadio do scleröçio. I scleröti pe-o sòlito en de forma spessa, neigra, sferica ò irregolare, longhi da 5,2 à 7,7 mm e de diametro da 3,4 à 5,3 mm (figua 1B). Sciben che quattro isoæ an sviluppou un modello marginale de scleròçia in sciô bòrdo do mezzo de coltua dòppo 10-12 giorni d’incubaçion à 25 ± 2 °C (fig. 1A), o numero de scleròçia pe placca o l’ea scignificativamente despægio tra de loiatri (P < 0.001), co-o numero ciù erto de ha333). 1,53 scleröti pe placca; Do mæximo, l’isolou n.3 o l’à produto ciù açido ossalico inte PDB che inti atri isoæ (3,33 ± 0,49 μg.mL-1; figua 1D). L’isolou n.3 o l’à mostrou de caratteristiche morfològiche e microscòpiche tipiche do fongo fitopatògeno Sclerotinia sclerotiorum. Pe fâ un exempio, in sce PDA, e colònie d’isolou n.3 cresceivan a-a spedia, ean gianche cremose (figua 1A), beige inverso ò giano-marron sarmon ciæo e aivan de beseugno de 6-7 giorni à 25 ± 2°C pe creuve do tutto a superfiçie de unna placca de diametro 9 cm. In sciâ base de caratteristiche morfològiche e microscòpiche stæte mensunæ de d’ato, l’isolou n.3 o l’é stæto identificou comme sclerotiña sclerötiorum.
Figua 1. Caratteristiche e patogeniçitæ di isoæ de S. sclerotiorum da-e cortue de leguminose commun. (A) Crescita miçeliale de quattro isoæ de S. sclerotiorum in sce un mezzo PDA, (B) sclerötie de quattro isoæ de S. sclerotiorum, (C) quantitæ de scleròtie (pe placca), (D) secreçion d’açido ossalico in sce mezzo PDB (μg.mL-1) e (E) scleròtie in sce mezzo PDB (μg.mL-1) e (E) scleròtie cortivaçion de legumi commerciæ suscettile Giza 3 inte condiçioin de særa. I valoî representan a media ± SD de çinque replici biològichi (n = 5). De lettie despæge indican de differense scignificative da-o ponto de vista statistico tra-i trattamenti (p < 0,05). (F-H) I tipichi scintomi de moffa gianca en comparsi in scî stemmi e in scî silici in sciô terren, rispettivamente, 10 giorni dòppo l’inocolaçion con l’isolou n.3 (dpi). (I) L’analixi evolutiva da region do spaçiatô trascrito interno (ITS) de l’isolou de S. sclerotiorum n.3 a l’é stæta fæta pe mezo do metodo da mascima probabilitæ e confrontâ con 20 isoæ/çeppi de referensa ottegnui da-a base de dæti do Çentro Naçionale pe l’Informaçion in scê Biotecnologie (NCBI). I numeri de d'ato a-e linie d'aggruppamento indican a covertua da region (%) e i numeri de sotta a-e linie d'aggruppamento indican a longhixe da ramma.
Pe de ciù, pe confermâ a patògeniçitæ, quattro isoæ de S. sclerotiorum ottegnui en stæti deuviæ pe inocolâ a cortivaçion de faxeu commerciale suscettile Giza 3 inte condiçioin de særa, cösa ch’a l’é coerente co-i pòstulæ de Koch (fig. 1E). Sciben che tutti i isoæ de fonzi ottegnui ean patògeni e poeivan infettâ o faxeu verde (cv. Giza 3), con provocâ di tipichi scintomi de moffa gianca in sce tutte e parte in sciô terren (fig. 1F), sorviatutto in scê gamba (fig. 1G) e in scê baccelle (fig. 1H) l’é stæto a-o mascimo o postsolaçion (inoculaçion (fig. 1H da)) a-o 10 isoou aggrescivo inte doî esperimenti independenti. L’isolou 3 o l’aiva a gravitæ da mouttia ciù erta (%) in scê ciante de faxeu (24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0 e 76,7 ± 3,1 a-i 7, 14 e 21 giorni dòppo l’infeçion rispettivamente; figua 1F).
L’identificaçion de l’isolou de S. sclerotiorum ciù invasivo n.3 a l’é stæta confermâ ancon in sciâ base do sequensiamento do spaçiatô trascrito interno (ITS) (fig. 1I). L’analixi filogenetica tra l’isolou n.3 e 20 isoæ/çeppi de referensa a l’à mostrou unn’erta sumeggiansa (>99%) tra de liatri. Va dito che l’isolou de S. sclerotiorum n.3 (533 bp) o l’à unn’erta sumeggiansa con l’isolou american de S. sclerotiorum LPM36 isolou da-e semense de poïscio secco (numero d’açescion da GenBank MK896659.1; 540 bp) e o numero d’açescion de S. OR206374,1; 548 bp), ch’o pròvoca a putrefaçion do stemma violetta (Matthiola incana), che son tutte aggruppæ pe conto seu in sciâ çimma do dendrogramma (figua 1I). A neuva sequensa a l’é stæta depoxitâ inta banca de dæti do NCBI e a l’é stæta ciammâ «Sclerotinia sclerötiö – isolou YN-25» (numero d’açescion da GenBank PV202792). Se peu nottâ che l’isolou 3 o l’é l’isolou ciù invasivo; donca, st’isolou o l’é stæto çernuo pe-o studio inte tutti i esperimenti vegnui apreuvo.
L’attivitæ antibattëia da diamina L-ornitiña (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germania) à de conçentraçioin despæge (12,5, 25, 50, 75, 100 e 125 mg/L) contra l’isolou 3 de S. sclerotiorum a l’é stæta studiâ in vitro. Va dito che a L-ornitiña a l’exerçitava un effetto antibattëio e pöco à pöco a l’inibiva a crescita radiale de ife de S. sclerotiorum à unna mainea dependente da-a dòse (figua 2A, B). A-a conçentraçion ciù erta testâ (125 mg/L), a L-ornitiña a l’à demostrou o tasso d’inibiçion da crescita miçeliale ciù erto (99,62 ± 0,27%; figua 2B), ch’o l’ea equivalente a-o fonziçida commerçiale Rizolex-T testou (tascio d’inibiçion ciù erto 99,3% Figua 2B; (10 mg/L), ch’o l’indica unn’efficaçitæ pægia.
Figua 2. Attivitæ antibattëia in vitro da L-ornitiña contra a scleròttiña. (A) Confronto de l’attivitæ antibattëia de diverse conçentraçioin d’ornitiña contra S. sclerotiorum co-o fonziçida Rizolex-T (10 mg/L). (B, C) Tasso d’inibiçion (%) da crescita miçeliale de S. sclerotiorum dòppo o trattamento con de conçentraçioin despæge de L-ornitiña (12,5, 25, 50, 75, 100 e 125 mg/L) ò Rizolex-T (2, 4, 6, 8/10 mg/l) rispettivamente. I valoî representan a media ± SD de çinque replici biològichi (n = 5). De lettie despæge indican de differense statistiche tra-i trattamenti (p < 0,05). (D, E) Analixi de regrescion do modello Probit de L-ornitiña e fonziçida commerciale Rizolex-T rispettivamente. A linia de regrescion do modello probit a l’é mostrâ comme unna linia bleu continua e l’intervallo de confiansa (95%) o l’é mostrou comme unna linia rossa trattezzâ.
Pe de ciù, l’é stæto fæto unn’analixi de regrescion probit e i grafichi correspondenti son mostræ inta tabella 1 e inte figue 2D,E. In curta, o valô de pendensa açettabile (y = 2,92x - 4,67) e e statistiche scignificative assoçiæ (Cox & Snell R2 = 0,3709, Nagelkerke R2 = 0,4998 e p < 0,0001; figua 2D) de L-ornitiña confrontâ unn’attivitæ commerciale ciù grande. fonziçida Rizolex-T (y = 1,96x - 0,99, Cox & Snell R2 = 0,1242, Nagelkerke R2 = 0,1708 e p < 0,0001) (tabella 1).
Tabella 1. Valoî da conçentraçion inibitoa meza mascima (IC50) e IC99 (mg/l) de L-ornitiña e fonziçida commerciale «Rizolex-T» contra S. sclerotiorum.
Into complescivo, a L-ornitiña (250 mg/L) a l’à reduto scignificativamente o sviluppo e a gravitæ da moffa gianca in scê ciante de faxeu commun trattæ in confronto a-e ciante infetæ da S. sclerotiorum no trattæ (controllo; figua 3A). In curta, sciben che a gravitæ da mouttia de ciante de contròllo infetæ no trattæ a l’é aumentâ pöco à pöco (52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61 e 92,33 ± 3,06%), a L-ornitiña a l’à reduto scignificativamente a gravitæ da mouttia (%) inte tutto o corso de l’esperimento (8,0 ± 0,0). 1,00 e 26,36 ± 3,07) a-i 7, 14 e 21 giorni dòppo o trattamento (dpt) rispettivamente (figua 3A). Do mæximo, quande e ciante de faxeu infette da S. sclerotiorum en stæte trattæ con 250 mg/L de L-ornitiña, l’area sotta a curva de progrescion da mouttia (AUDPC) a l’é diminuia da 1274,33 ± 33,13 into contròllo no trattou à 281,03 ± 7,95 mg poxitivo, ch’o l’ea ciù basso che o contròllo poxitivo de s. Fongiçida Rizolex-T (183,61 ± 7,71; figua 3B). A mæxima tendensa a l'é stæta osservâ into segondo esperimento.
Fig. 3. Effetto de l’applicaçion esogenica de L-ornitiña in sciô sviluppo da putrefaçion gianca do faxeu commun provocou da Sclerotinia sclerotiorum inte condiçioin de særa. (A) Curva de progrescion da mouttia do moggio gianco de faxeu commun dòppo o trattamento con 250 mg/L de L-ornitiña. (B) Area sotta a curva de progrescion da mouttia (AUDPC) do moggio gianco de faxeu commun dòppo o trattamento con L-ornitiña. I valoî representan a media ± SD de çinque replici biològichi (n = 5). De lettie despæge indican de differense scignificative da-o ponto de vista statistico tra-i trattamenti (p < 0,05).
L’applicaçion esogenica de 250 mg/L de L-ornitiña a l’à aumentou pöco à pöco l’ertessa da cianta (fig. 4A), o numero de ramme pe cianta (fig. 4B) e o numero de feugge pe cianta (fig. 4C) dòppo 42 giorni. Tanto che o fonziçida commerciale Rizolex-T (50 mg/L) o l’à avuo l’effetto ciù grande in sce tutti i parametri nutriçionali studiæ, l’applicaçion esogenica de 250 mg/L de L-ornitiña a l’à avuo o segondo effetto ciù grande in confronto a-i contròlli no trattæ (fig. 4A-C). D’atro canto, o trattamento con L-ornitiña o no l’à avuo nisciun effetto scignificativo in sciô contegnuo di pigmenti fotoscintetichi clorofilla a (fig. 4D) e clorofilla b (fig. 4E), ma o l’à aumentou un pittin o contegnuo totale de carotenòidi (0,56 ± 0,03 mg2) p2 ±03 mg/g fr wt e 0.0. contròllo poxitivo (0,46 ± 0,02 mg/g in peso; fig. 4F). Into complescivo, sti resultati indican che a L-ornitiña a no l’é fitotòscica pe-e leguminose trattæ e a peu fiña stimolâ a seu crescita.
Fig. 4. Effetto de l’applicaçion esogena de L-ornitiña in scê caratteristiche de crescita e in scî pigmenti fotoscintetichi de feuggie de faxeu infetæ da Sclerotinia sclerotiorum inte condiçioin de særa. (A) Ertixe da cianta (cm), (B) Quantitæ de ramme pe cianta, (C) Quantitæ de feugge pe cianta, (D) Contegnuo de clorofilla a (mg g-1 peso), (E) Contegnuo de clorofilla b (mg g-1 peso), (F) Contegnuo totale de carotenòidi (mg g-1 fr). I valoî son a media ± SD de çinque replici biològichi (n = 5). De lettie despæge indican de differense scignificative da-o ponto de vista statistico tra-i trattamenti (p < 0,05).
A localizzaçion istochimica in situ de speçie d’oscigeno reattivo (ROS; espresso comme peròscido d’idrògeno [H2O2]) e di radicali liberi (espressi comme anioin de superòscido [O2•−]) a l’à revelou che l’applicaçion esogenica de L-ornitiña (250 mg/L) a l’à reduto scignificativamente l’accumulo de H,5.30. nmol.g-1 FW; figua 5A) e O2•- (32,69 ± 8,56 nmol.g-1 FW; figua 5B) in confronto à l’accumulo tanto de ciante infette no trattæ (173,31 ± 12,06) comme de 149,35 ± 7,94 nmol respettive e W. mg/L do fonziçida commerciale Rizolex-T (170,12 ± 9,50 e 157,00 ± 7,81 nmol.g-1 fr in peso, rispettivamente) à 72 h. Di erti livelli de H2O2 e O2•− ammuggiæ sotta hpt (fig. 5A, B). Do mæximo, l’analixi in sciô malondialdeide (MDA) basou in sce TCA o l’à demostrou che e ciante de faxeu infetæ da S. sclerotiorum ammuggiavan di livelli ciù erti de MDA (113,48 ± 10,02 nmol.g fr wt) inte seu feugge (fig. 5C). À tutti i mòddi, l’applicaçion esogenica de L-ornitiña a l’à reduto scignificativamente a peroscidaçion di lipidi, comme demostrou da-a diminuçion do contegnuo de MDA inte ciante trattæ (33,08 ± 4,00 nmol.g fr wt).
Fig. 5. Effetto de l’applicaçion esogena de L-ornitiña in scî marcatoî prinçipæ do stress oscidativo e in scî meccanismi de defeisa antioscidante no enzimatichi inte feugge de faxeu infetæ da S. sclerotiorum à 72 h dòppo l’infeçion inte condiçioin de særa. (A) Peròscido d’idrògeno (H2O2; nmol g-1 FW) à 72 cv, (B) anion superòscido (O2•-; nmol g-1 FW) à 72 cv, (C) malondialdeide (MDA; nmol g-1 FW) à 72 cv, (D) fenoli solubili totali à 72 cv (E) flavonòidi solubili totali (mg RE g-1 FW) à 72 cv, (F) aminoaçidi liberi totali (mg g-1 FW) à 72 cv e (G) contegnuo de proliña (mg g-1 FW) à 72 cv. I valoî representan a media ± a deviaçion standard (media ± DS) de 5 replici biològichi (n = 5). De lettie despæge indican de differense scignificative da-o ponto de vista statistico tra-i trattamenti (p < 0,05).