Presente *Indirizzo corrente: Colònia 50931, Germania, Colònia Reçerca de gruppo d'eccellensa in sciâ respòsta a-o stress çellolare inte mouttie ligæ à l'invegiamento (CECAD).
A neurodegeneraçion de mouttie mitocondriale a l’é consciderâ irreverscibile perché a plastiçitæ metabòlica di neuroin a l’é limitâ, ma l’effetto da disfonçion mitocondriale in sce l’autonomia de çellole do metabolismo neuronale into còrpo o no l’é ancon ben compreiso. Chì introduemmo o proteöma speçifico de çellole di neuroin de Purkinje con unna carensa progresciva d’OXPHOS provocâ da unna dinamica de fuxon mitocondriale interrotta. Noemmo l’é stæto nottou che a disfonçion mitocondriale a l’à provocou un cangio profondo into campo da proteòmica, che in sciâ fin o l’à portou à l’attivaçion sequensiale de programmi metabòlichi preçixi primma da mòrte de çellole. À un mòddo inaspëtou, emmo determinou l’induçion òvvia da carboscilaxi do piruvato (PCx) e d’atri enzimi anti-invegiamento che completan i intermedi do çiclo TCA. L’inibiçion de PCx a l’à aggravou o stress oscidativo e a neurodegeneraçion, cösa ch’a l’indica che l’ateroscleroxi a l’à un effetto protettivo inti neuroin che n’an de OXPHOS. O restauro da fuxon mitocondriale inti neuroin degeneræ terminalmente o l’inversa do tutto ste caratteristiche metabòliche, e donca o prevëgne a mòrte de çellole. E nòstre descoverte identifican di percorsci desconosciui primma che conferiscian a rescistensa a-a disfonçion mitocondriale e mostran che a neurodegeneraçion a peu vegnî inversâ anche inte fase tarde da mouttia.
O ròllo çentrale di mitocondri into mantegnî o metabolismo de l’energia neuronale o l’é enfatizzou da-i esteixi scintomi neurològichi assoçiæ a-e mouttie mitocondriale de l’òmmo. A ciù parte de ste mouttie a l’é provocâ da de mutaçioin genice che regolan l’esprescion genica mitocondriale (1, 2) ò da destruçion genica ligâ a-a dinamica mitocondriale, che influensan indirettamente a stabilitæ do DNA mitocondriale (mtDNA) (3, 4). O travaggio in sce di modelli animali o l’à demostrou che in respòsta a-a disfonçion mitocondriale inti tesciui d’in gio, se peu attivâ di percorsci metabòlichi conservatoî (5-7), cösa ch’a fornisce de informaçioin importante pe unna comprenscion approfondia da patogenexi de ste mouttie complesse. Pe contrasto, a nòstra comprenscion di cangi metabòlichi de tipi speçifichi de çellole provocæ da-o fallimento generale da produçion d’adenosiña trifosfato (ATP) mitocondriale do çervello a l’é fondamentale (8), e a l’enfatizza a neçescitæ d’identificâ di obiettivi terapeutichi che peuan vegnî deuviæ pe prevëgnî ò prevegnî e mouttie. Prevegnî a neurodegeneraçion (9). A mancansa d’informaçioin a l’é o fæto che e çellole nervose en conscideræ pe commun pe avei unna flescibuilitæ metabòlica assæ limitâ in confronto a-i tipi de çellole di tesciui d’in gio (10). Dæto che ste çellole zeugan un ròllo primmäio inta coordinaçion da fornitua de metaboliti a-i neuroin pe promeuve a trasmiscion scinaptica e responde à de condiçioin de lexon e de mouttia, a capaçitæ d’adattâ o metabolismo de çellole a-e condiçioin diffiçile do tesciuo do çervello a l’é squæxi limitâ a-e çellole gliale (11-14). Pe de ciù, l’eterogeneitæ çellolare intrinseca do tesciuo do çervello a l’impedisce pe-a ciù parte o studio di cangi metabòlichi che se verifican inte di sottogruppi neuronali speçifichi. De conseguensa, se conosce pöco in scê conseguense esatte de çellole e metabòliche da disfonçion mitocondriale inti neuroin.
Pe capî e conseguense metabòliche da disfonçion mitocondriale, emmo isoou di neuroin de Purkinje (PN) inte diverse fase de neurodegeneraçion provocâ da-a destruçion da fuxon da membraña esterna mitocondriale (Mfn2). Sciben che e mutaçioin de Mfn2 inti òmmi en assoçiæ à unna forma de neuropatia sensoriale motorica ereditäia conosciua comme tipo 2A de Charcot-Marie-Tooth (15), a destruçion condiçionâ de Mfn2 inti ratti a l’é unn’induçion ben reconosciua da disfonçion da fosforillaçion d’oscidaçion (OXthoPHOS). I diversci sottotipi neuronali (16-19) e o fenotipo neurodegenerativo ch’o ne sciòrte en accompagnæ da di scintomi neurològichi progrescivi, comme di desturbi do movimento (18, 19) ò l’atascia do çervello (16). Pe mezo de unna combinaçion de proteòmica quantitativa sensa etichetta (LFQ), metabolomica, imaging e metodi virològichi, demostremmo che a neurodegeneraçion progresciva a l’induxe fortemente a carboscilaxi do piruvato (PCx) e di atri fattoî ligæ à l’arterioscleroxi di PN in vivo L’esprescion di enzimi. Pe verificâ a pertinensa de sta descoverta, emmo regolou into dettaggio l’esprescion de PCx inte PN con defiçensa de Mfn2 e emmo nottou che st’operaçion a l’à aggravou o stress oscidativo e a neurodegeneraçion accelerâ, demostrando coscì che l’azoospermia a conferisce l’adattabilitæ metabòlica a-a mòrte de çellole. L’esprescion grave de MFN2 a peu sarvâ do tutto a degeneraçion terminale PN con unna grave carensa d’OXPHOS, un consummo massiscio de DNA mitocondriale e unna ræ mitocondriale ch’a pâ rotta, cösa ch’a l’enfatizza ancon de ciù che sta forma de neurodegeneraçion a peu fiña repiggiâse into stadio avansou da mouttia de çellole.
Pe visualizzâ i mitocondri inti PN knockout de Mfn2, emmo deuviou un çeppo de ratto ch’o permette a-i mitocondri dependenti da Cre de mirâ l’esprescion Cre da proteiña fluorescente giana (YFP) (mtYFP) (20) e emmo controllou a morfologia mitocondriale in vivo. Noemmo l’é stæto nottou che a destruçion do gene Mfn2 inti PN a l’avieiva portou a-a divixon gradduale da ræ mitocondriale (figua S1A) e o primmo cangio o l’é stæto attrovou à træ settemañe d’etæ. Pe contra, a degeneraçion sostansiale do seu de çellole PN, comme demostrou da-a perdia de l’immunocoloraçion de Calbindin, a no l’é comensâ fin à 12 settemañe d’etæ (figua 1, A e B). A discrepansa de tempo tra i primmi cangi inta morfologia mitocondriale e l’incomenso vixibile da mòrte neuronale a n’à portou à studiâ i cangi metabòlichi provocæ da-a disfonçion mitocondriale primma da mòrte de çellole. Noemme emmo sviluppou unna strategia basâ in sciâ classificaçion de çellole attivâ da-a fluorescensa (FACS) pe isolâ PN ch’o l’esprimme YFP (figua 1C) e inte di ratti contròllo (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), ciammæ inte sto chì CT1BRL (figua). L’ottimizzaçion da strategia de gating basâ in sce l’intensitæ relativa do segnâ YFP a ne permette de purificâ o còrpo YFP+ (YFPhigh) di PN da-i no PN (YFPneg) (figua S1B) ò da-i frammenti d’asson/dendritichi fluorescenti putativi (YFPlow; figua S1D confermou da-a manciña). Pe verificâ l’identitæ da popolaçion clascificâ, emmo fæto a proteòmica LFQ e dapeu l’analixi di componenti prinçipæ e emmo nottou che gh’é unna separaçion ciæa tra e çellole YFPhigh e YFPneg (figua S1C). E çellole YFPhigh an mostrou un inricchimento netto de marcatoî PN conosciui (saieiva à dî Calb1, Pcp2, Grid2 e Itpr3) (21, 22), ma nisciun inricchimento de proteiñe espresse pe commun inti neuroin ò inte di atri tipi de çellole (figua 1D) ). Un confronto tra-i campioin inte çellole YFPhigh clascificæ arrecuggeite inte di esperimenti independenti o l'à mostrou un coeffiçente de correlaçion> 0,9, ch'o mostra unna boña reproduçibilitæ tra-i replici biològichi (figua S1E). Pe dîla curta, sti dæti an validou o nòstro progetto pe l'isolamento aguo e speçifico de PN fattibile. Dæto che o scistema de condutô L7-cre deuviou o l’induxe a recombinaçion mosaica inta primma settemaña dòppo o parto (23), emmo comensou à scassâ di ratti da-o CTRL e à arrecheugge di neuroin condiçionæ. Dòppo ch’a recombinaçion a l’é completâ, a piggia o nomme de Mfn2cKO à 4 settemañe d’etæ. Comme ponto finale, emmo çernou 8 settemañe d’etæ quande o seu PN o l’ea intatto ascì co-a frammentaçion mitocondriale òvvia (figua 1B e figua S1A). Inte l’insemme, emmo quantificou un totale de 3013 proteiñe, di quæ o 22% pöcassæ o se basava in scê annotaçioin MitoCarta 2.0 basæ in sciô proteöma mitocondriale comme mitocondri (figua 1E) (24). L’analixi differensiale de l’esprescion genica fæta a-a settemaña 8 a l’à demostrou che solo o 10,5% de tutte e proteiñe o l’aiva di cangi scignificativi (figua 1F e figua S1F), di quæ 195 proteiñe ean regolæ in basso e 120 ean regolæ in çimma (figua 1F). Va dito che l’«analixi innovativa do percorso» de sto insemme de dæti a mostra che i geni espressi de forma differensiale appartëgnan pe-o ciù à un insemme restreito de percorsci metabòlichi speçifichi (figua 1G). Curiosamente, sciben che a regolaçion bassa di percorsci ligæ à OXPHOS e a segnalaçion do calcio a conferma l’induçion da disfonçion mitocondriale inte PN con defiçensa de fuxon, de atre categorie che an da fâ pe-o ciù co-o metabolismo di aminoaçidi en scignificativamente regolæ in çimma, cösa ch’a l’é in linia co-o metabolismo mitocondriale ch’o se verifica into PN mitocondriale. disfonçion.
(A) Fòtografe confocale representative de seçioin çerebellæ de ratti CTRL e Mfn2cKO che mostran unna perdia progresciva de PN (calbindiña, grixa); i nuclei en stæti contracoloæ con DAPI. (B) Quantificaçion de (A) (analixi à senso unico da variansa, ***P<0,001; n = da 4 à 6 çerci da trei ratti). (C) Flusso de travaggio sperimentale. (D) Distribuçion da mappa de calô di marcatoî speçifichi pe Purkinje (in çimma) e di atri tipi de çellole (in mezo). (E) Diagramma de Venn ch’o mostra a quantitæ de proteiñe mitocondriale identificæ into PN clascificou. (F) Grafico de vorcan de proteiñe espresse de forma differensiale inti neuroin Mfn2cKO à 8 settemañe (valô limite de scignificato de 1,3). (G) L'analixi do percorso de creativitæ a mostra i çinque percorsci ciù importanti de regolaçion in çimma (rosso) e in basso (bleu) into PN Mfn2cKO clascificou comme 8 settemañe. Se mostra o livello d’esprescion medio de tutte e proteiñe relevæ. Mappa de calô in sce scâ de grixi: valô P regolou. ns, no l'é importante.
I dæti da proteòmica an mostrou che l’esprescion proteica di complesci I, III e IV a l’é diminuia pöco à pöco. I complesci I, III e IV contegnivan tutti de sottounitæ essençiale codificæ da-o mtDNA, mentre o complesso II, ch’o l’ea codificou solo che da-o nucleo, o no l’ea in sostansa influensou (figua 2A e figua S2A). . In coerensa co-i resultati da proteòmica, l’immunoistochimica de seçioin de tesciui çerebellæ a l’à demostrou che o livello de sottounitæ MTCO1 (sottounitæ 1 de l’oscidaxi do citocromo C mitocondriale) do complesso IV inta PN o l’é diminuio pöco à pöco (figua 2B). A sottounitæ Mtatp8 codificâ da-o mtDNA a l’é stæta scignificativamente reduta (figua S2A), mentre o livello de staçionäio da sottounitæ de scintaxi ATP codificâ da-o nucleo o l’é arrestou invariou, cösa ch’a l’é coerente co-o complesso F1 de sottaassemblaggio de ATP scintaxi stabile conosciuo quande l’esprescion de mtDNA a l’é stabile. A formaçion a l'é coerente. Interrompî (7). A valutaçion do livello de mtDNA inti PN Mfn2cKO ordinai pe reaçion à cadeña de polimeraxi in tempo reale (qPCR) a l’à confermou a diminuçion gradduale do numero de còpie de mtDNA. In confronto a-o gruppo contròllo, à 8 settemañe d’etæ, solo o 20% pöcassæ do livello de mtDNA o l’é stæto mantegnuo (figua 2C). In coerensa con sti resultati, a coloraçion con microcoscopia confocale de PN Mfn2cKO a l’é stæta deuviâ pe relevâ o DNA, ch’a mostra o consummo dependente da-o tempo di nucleotidi mitocondriali (figua 2D). Noemmo l’é stæto nottou che solo çerti candidæ ligæ a-a degraddaçion da proteiña mitocondriale e a-a respòsta a-o stress ean regolæ in çimma, compreiso i fattoî d’assemblaggio complesci Lonp1, Afg3l2 e Clpx e OXPHOS. No l’é stæto nottou di cangi scignificativi inti livello de proteiñe ligæ à l’apoptoxi (figua S2B). Do mæximo, emmo nottou che i mitocondri e i cannæ do reticolo endoplasmico ligæ a-o traspòrto do calcio an solo di cangi ciù piccin (figua S2C). Pe de ciù, a valutaçion de proteiñe ligæ à l’autofagia a no l’à attrovou di cangi scignificativi, cösa ch’a l’é coerente con l’induçion vixibile d’autofagosömi osservâ in vivo pe mezo de l’immunoistochimica e da microcoscopia elettronica (figua S3). À tutti i mòddi, a disfonçion progresciva de OXPHOS inti PN a l’é accompagnâ da di cangi mitocondriali ultrastrutturali òvvi. Se peu nottâ di gruppi mitocondriali inti còrpi de çellole e inti erboi dendritichi de PN Mfn2cKO d’etæ 5 e 8 settemañe e a struttua da membraña interna a l’à patio di cangi profondi (figua S4, A e B). In coerensa con sti cangi ultrastrutturali e unna diminuçion scignificativa do mtDNA, l’analixi de fette do çerebello aguo con l’ester metilico de tetrametilrodamina (TMRM) a l’à demostrou che o potençiale de membraña mitocondriale inti PN Mfn2cKO o l’ea scignificativamente diminuio (figua S4C).
(A) Analixi do corso do tempo do livello d’esprescion do complesso OXPHOS. Consciderâ solo e proteiñe con P<0.05 à 8 settemañe (ANOVA à doî sensci). Linia pontettâ: Nisciuña regolaçion in confronto à CTRL. (B) À manciña: un exempio de seçion çerebellâ marcâ con un anticòrpo anti-MTCO1 (barra de scâ, 20 μm). L’aria occupâ da-i còrpi de çellole de Purkinje a l’é coverta da-o giano. À drita: Quantificaçion di livelli de MTCO1 (analixi à senso unico da variansa; n = da 7 à 20 çellole analizzæ da trei ratti). (C) Analixi qPCR do numero de còpie de mtDNA into PN ordinao (analixi à senso unico de variansa; n = da 3 à 7 ratti). (D) À manciña: un exempio de unna fetta do çerebello marcâ con un anticòrpo anti-DNA (barra de scâ, 20 μm). L’aria occupâ da-i còrpi de çellole de Purkinje a l’é coverta da-o giano. À drita: Quantificaçion de lexoin de mtDNA (analixi à senso unico da variansa; n = da 5 à 9 çellole da trei ratti). (E) Un exempio de seçion cerebellâ agua ch’a mostra de çellole mitoYFP + Purkinje (freccia) inte unna registraçion de morsetto de patch pe çellole intreghe. (F) Quantificaçion da curva IV. (G) Registraçioin representative d’inieçion de corrente depolarizzante inte çellole de Purkinje CTRL e Mfn2cKO. Traccia in çimma: O primmo impulso ch'o l'à descadenou AP. Traccia de fondo: Frequensa mascima AP. (H) Quantificaçion di input spontanei pòstscinaptichi (sPSP). A traccia de registraçion representativa e o seu rappòrto de zoom vëgnan mostræ inte (I). L'analixi à senso unico da variansa a l'à analizzou da n = 5 à 20 çellole da trei ratti. I dæti son espressi comme media±SEM; *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001. (J) Tracce representative de AP spontaneo registræ pe mezo da modalitæ de morsa de patch perforâ. Traccia de d’ato: Frequensa mascima AP. Traccia de fondo: zoom de un AP sencio. (K) Quantificâ a frequensa media e mascima AP segondo (J). Test do Mann-Whitney; n = 5 çellole en stæte analizzæ da quattro ratti. I dæti son espressi comme media±SEM; no l'é importante.
Un danno òvvio à OXPHOS o l’é stæto nottou into PN Mfn2cKO d’8 settemañe, cösa ch’a l’indica che a fonçion fixològica di neuroin a l’é gravemente anormale. De conseguensa, emmo analizzou e caratteristiche elettriche pascive di neuroin con defiçensa d’OXPHOS da-e 4 a-e 5 settemañe e da-e 7 a-e 8 settemañe, con fâ de registraçioin con morse de patch pe çellole intreghe inte de fette cerebellæ ague (figua 2E). À un mòddo inaspëtou, o potençiale medio da membraña de repòso e a rexistensa à l’input di neuroin Mfn2cKO s’assumeggiavan a-o contròllo, sciben che gh’ea de differense sottî tra e çellole (tabella 1). Do mæximo, da-e 4 a-e 5 settemañe d'etæ no s'é attrovou di cangi scignificativi inta relaçion corrente-tenscion (curva IV) (figua 2F). À tutti i mòddi, nisciun neuron Mfn2cKO d’etæ compreisa tra-e 7 e e 8 settemañe o l’é sopravivuo a-o regimme IV (passo d’iperpolarizzaçion), cösa ch’a l’indica che gh’é unna ciæa sensibilitæ a-o potençiale d’iperpolarizzaçion inte sto stadio tardio. Pe contra, inti neuroin Mfn2cKO, e corrente depolarizzante che pròvocan de descharge de potençiale d’açion repetitiva (AP) en ben tolleræ, cösa ch’a l’indica che i seu modelli de descharge complescivi no son scignificativamente despægi da quelli di neuroin de contròllo d’etæ d’8 settemañe (tabella 1 e figua 2G). Da mæxima, a frequensa e l'ampiessa de corrente postscinaptiche spontanee (sPSC) se poeivan confrontâ con quelle do gruppo contròllo e a frequensa di eventi a l'é cresciua da 4 settemañe à 5 settemañe à 7 settemañe à 8 settemañe con un aumento pægio (figua 2, H e I). O periodo de maturitæ scinaptica inti PN (25). Di exiti someggianti s’en ottegnui dòppo di patch de PN perforæ. Sta configuraçion a l’impedisce a poscibile compensaçion di difetti de ATP çellolare, comme porrieiva succede inta registraçion de morsetti de patch pe çellole intreghe. Ciù into dettaggio, o potençiale da membraña de repòso e a frequensa de sparâ spontanea di neuroin Mfn2cKO no en stæti influensæ (figua 2, J e K). Pe compilâ, sti exiti indican che i PN con unna disfonçion OXPHOS òvvia peuan affrontâ ben i modelli de descharge à erta frequensa, cösa ch’a l’indica ch’existe un mecanismo de compensaçion ch’o ghe permette de mantegnî de respòste elettrofixològiche squæxi normale.
I dæti son espressi comme media ± SEM (analixi de variansa à senso unico, test de confronto multiplo do Holm-Sidak; *P<0,05). O numero de l’unitæ o l’é indicou tra de parentexi.
Noemme emmo comensou à indagâ se quarche categoria into dataset de proteòmica (figua 1G) a comprende di percorsci che peuan contrastâ unna grave carensa d’OXPHOS, spiegando coscì perché a PN interessâ a peu mantegnî unn’elettrofisiologia squæxi normale (figua 2, da E à K). . L’analixi da proteòmica a l’à demostrou che i enzimi ligæ a-o catabolismo di aminoaçidi à cadeña rammificâ (BCAA) ean scignificativamente regolæ in çimma (figua 3A e figua S5A) e o produto finale açetil-CoA (CoA) ò succinilo CoA peuan supplementâ i tricarboscilæ inte l’arterioscleròxi arterioscleròdica). Noemmo l’é stæto nottou che o contegnuo de trasaminaxi BCAA 1 (BCAT1) e BCAT2 o l’é aumentou segge. Catalizzan o primmo passo do catabolismo de BCAA co-a generaçion de glutammato da-o α-chetoglutarato (26). Tutte e sottounitæ che compoñan o complesso chetoaçido deidrogenaxi à cadeña rammificâ (BCKD) en regolæ in çimma (o complesso o catalizza a decarboscilaçion succesciva e irreverscibile do scheletro de carbònio BCAA ch’o ne resulta) (figua 3A e figua S5A). À tutti i mòddi, no s’é attrovou di cangi òvvi into mæximo BCAA into PN sortivou, che peuan ëse dovui à l’aumento de l’asciorbimento çellolare de sti aminoaçidi essençiali ò à l’utilizzaçion d’atre vivagne (glucòsio ò açido lattico) pe supplementâ o çiclo TCA (figua S5B). I PN sensa OXPHOS an mostrou ascì unn’aumento de attivitæ de decompoxiçion e de trasaminaçion da glutamina à 8 settemañe d’etæ, cösa ch’a peu ëse refletta da-a regolaçion in çimma di enzimi mitocondriali glutaminaxi (GLS) e trasaminaxi 2 (GPT2) di enzimi mitocondriali (figua 3, A e C). Va dito che a regolaçion in çimma de GLS a l’é limitâ à l’isoforma glutaminaxi C spliçiâ (GLS-GAC) (o cangio de Mfn2cKO/CTRL o l’é 4,5 vòtte pöcassæ, P = 0,05) e a seu regolaçion in çimma speçifica inti tesciui cançeroxi a peu sostegnî o mitonergiondriale. (27)
(A) A mappa do calô a mostra o cangio de crenatua into livello de proteiñe pe-a via speçificâ à 8 settemañe. (B) Exempio de unna fetta do çerebello marcâ con un anticòrpo anti-PCx (barra de scâ, 20 μm). A freccia giana a ponta a-o còrpo de çellole de Purkinje. (C) Analixi de l’esprescion de proteiñe into corso do tempo identificâ comme un candidou importante pe l’ateroscleroxi (test t multiplo, *FDR <5%; n = 3-5 ratti). (D) De d’ato: un diagramma schematico ch’o mostra e diverse mainee d’intrâ into carbònio marcou contegnuo into tracciatô de piruvato [1-13C] (saieiva à dî pe mezo de PDH ò pe via transarteriosa). In fondo: o grafico do violino o mostra a perçentuale de carbònio marcou à un solo marco (M1) convertio inte de l’açido aspartico, de l’açido çitrico e de l’açido malico dòppo avei marcou e fette do çerebello aguo con [1-13C]piruvato (test t in cobbia; ** P <0.01). (E) Analixi completa da stöia do tempo do percorso indicou. Consciderâ solo e proteiñe con P<0.05 à 8 settemañe. Linia trattezzâ: nisciun valô d'aggiustamento (analixi à doî sensci da variansa; * P <0,05; *** P <0,001). I dæti son espressi comme media±SEM.
Inta nòstra analixi, o catabolismo de BCAA o l’é vegnuo un di percorsci ciave pe-a regolaçion in çimma. Sto fæto o suggerisce fortemente che o volumme de ventilaçion ch'o l'intrâ into çiclo TCA o peu ëse cangiou inte PN sensa OXPHOS. Sto fæto o peu rappresentâ unna forma importante de recablaggio metabòlico neuronale, ch’o peu avei un impatto diretto in sciâ fisiologia neuronale e in sciâ sopravivensa durante o mantegnimento de unna grave disfonçion OXPHOS. In coerensa con st’ipòtexi, emmo nottou che l’enzima antiateroscleròtico prinçipâ PCx o l’é regolou in çimma (Mfn2cKO/CTRL o cangia 1,5 vòtte pöcassæ; figua 3A), ch’o catalizza a converscion do piruvato inte ossaloaçetato (28), ch’o se pensa ch’o segge inte l’esprescion do tesciuo a2). 30). In coerensa co-i exiti da proteòmica, a microcoscopia confocale a l’à demostrou che l’esprescion de PCx a l’ea aumentâ de forma speçifica e scignificativa inte PN con defiçensa d’OXPHOS, mentre a reattivitæ de PCx a l’ea restreita pe-o ciù a-e çellole gliale de Bergmann vexiñe a-o contròllo (figua 3B). Pe verificâ fonçionalmente l’opregolaçion osservâ de PCx, emmo trattou de fette cerebellæ ague con un tracciatô de piruvato [1-13C]. Quande o piruviato o l’é stæto oscidou da-a piruviato deidrogenaxi (PDH), a seu marca isòtopa a l’é scentâ, ma a l’é incorporâ inti intermedi do çiclo TCA quande o piruviato o l’é metabolizzou da de reaçioin vascolare (figua 3D). À sostegno di nòstri dæti de proteòmica, emmo osservou unna gran quantitæ de marcatoî da sto tracciatô inte l’açido aspartico de fette de Mfn2cKO, mentre l’açido çitrico e l’açido malico aivan ascì unna tendensa moderâ, sciben che no scignificativa (figua 3D).
Inti neuroin dopaminæ de ratti MitoPark con unna disfonçion mitocondriale provocâ da-i neuroin dopaminæ che destruxan into dettaggio o gene do fattô de trasmiscion mitocondriale A (Tfam) (figua S6B), l’esprescion de PCx a l’ea scignificativamente regolâ in çimma ascì (31), cösa ch’a l’indica che l’arterioscleroxi de l’açido açetönico a l’é a disfonçion da OSFO into còrpo. Va dito che l’é stæto nottou che di enzimi unichi (32-34) che peuan vegnî espressi inti neuroin che peuan ëse assoçiæ à l’arterioscleroxi en scignificativamente regolæ in çimma inte PN che n’an de OXPHOS, comme a carboscilaxi propionil-CoA (PCC-A), a malonil-CoA e a succilion-CoA convertan inte propionil-CoA. enzima 3 (ME3), che o seu ròllo prinçipâ o l’é de recuperâ o piruvato da-o malato (figua 3, A e C) (33, 35). Pe de ciù, emmo attrovou un aumento scignificativo de l’enzima Pdk3, ch’o fosforila e donca o l’inattiva o PDH (36), mentre no s’é nottou di cangi inte l’enzima Pdp1 ch’o l’attiva o PDH ò into mæximo complesso enzimatico PDH (figua 3A). De conseguensa, inti PN de Mern2cKO, a fosforillaçion da sottounitæ α1 α (PDHE1α) do componente da piruvato deidrogenaxi E1 do complesso PDH inte Ser293 (conosciuo pe inibî l’attivitæ enzimatica de PDH) a l’é stæta megioâ (figua S6C) (figua S6C). O piruvato o no l’à de accesso vascolare.
Pe finî, emmo nottou che o superpercorso da bioscintexi de seriña e gliciña, o çiclo do folato mitocondriale (1C) e a bioscintexi da proliña (figua 1G e figua S5C) en tutti scignificativamente regolæ in çimma, segondo i rappòrti, durante o proçesso d’attivaçion. I tesciui d’in gio vëgnan attivæ con unna disfonçion mitocondriale (5-7). L’analixi confocale ch’a sostëgne sti dæti de proteòmica a l’à demostrou che inte PN con mancansa de OXPHOS, de fette do çerebello de ratti d’etæ d’8 settemañe en stæte sottopòste à l’idròscimetiltrasferaxi 2 de seriña (SHMT2), un enzima ciave do çiclo do folato mitocondriale. Responsa immunitäia scignificativa (figua S5D). Inte 13 fette do çerebello aguo incubæ con glucòsio CU, i esperimenti de tracciamento metabòlico an confermou ancon de ciù l’overregolaçion da bioscintexi da seriña e da proliña, cösa ch’a l’indica che o flusso d’isoforme de carbònio inta seriña e inta proliña o l’é aumentou (figua S5E). Dæto che e reaçioin promosse da GLS e GPT2 en responsabile da scintexi do glutammato da-a glutamina e da trasaminaçion tra glutammato e α-chetoglutarato, a seu regolaçion in çimma a l’indica che i neuroin con carenza d’OXPHOS an unna domanda aumentâ de glutammato. A-o conträio de sti cangi, unn’analixi proteòmica di astroçiti çerebellæ de ratti Mfn2cKO speçifichi pe PN a l’à demostrou che sti percorsci (compreiso tutte e antiperòscidaxi) no cangian de forma scignificativa inte l’esprescion, demostrando coscì che sta redireçion metabòlica a l’é selettiva pe-o PN degraddou à D à G (fig. S6).
Pe compilâ, ste analixi an revelou di modelli scignificativamente despægi d’attivaçion temporale de percorsci metabòlichi speçifichi inti PN. Sciben che a fonçion mitocondriale neuronale anormale a peu portâ à unn’ateroscleroxi tempoia e a-o remodellamento 1C (figua 3E e figua S5C), e fiña à di cangi preveddibili inte l’esprescion di complesci I e IV, i cangi inta scintexi de seriña de novo son solo che son vegnui evidenti solo che inta fase tardia. Disfonçion OXPHOS (figua 3E e figua S5C). Ste descoverte definiscian un proçesso sequensiale donde o mitocondrio (çiclo 1C) e o citoplasmatico (bioscintexi de seriña) induti da-o stress respondan de forma sinergica con l’aumento de l’ateroscleroxi into çiclo TCA pe remodellâ o metabolismo neuronale.
I PN con carenza d’OXPHOS d’etæ de 8 settemañe peuan mantegnî unn’attivitæ d’eccitaçion à erta frequensa e subî unna reconnescion metabòlica scignificativa pe compensâ a disfonçion mitocondriale. Sta descoverta a l’alimenta unna poscibilitæ interessante che anche inte sto momento ste çellole pòssan reçeive ascì un intervento terapeutico pe retardâ ò prevëgnî a neurodegeneraçion. Tardi. Noemme emmo destrigou sta poscibilitæ pe mezo de doe intervençioin independente. Into primmo metodo emmo progettou un vettô de virus assoçiou à l’adeno dependente da Cre (AAV) de mòddo che MFN2 o pòsse vegnî espresso selettivamente inte di PN con defiçensa d’OXPHOS in vivo (figua S7A). L’AAV ch’o codifica pe MFN2 e o gene reporter fluorescente mCherry (Mfn2-AAV) en stæti verificæ inte coltue de neuroin primmäi in vitro, cösa ch’a l’à fæto de mòddo che MFN2 o fïse espresso à unna mainea dependente da Cre e o l’à rescatou a morfologia mitocondriale, prevenndo coscì a neuromutaçion inti neuroin Mfn2c7. Pe avanti, emmo fæto di esperimenti in vivo pe consegnâ stereotaticamente Mfn2-AAV d’etæ de 8 settemañe a-a cortexa çerebellâ de Mfn2cKO e de ratti contròllo e emmo analizzou di ratti d’etæ de 12 settemañe (figua 4A). I ratti trattæ con Mfn2cKO en mòrti (figua 1, A e B) (16). A trasduçion virale in vivo a l’à portou à l’esprescion selettiva de PN inte çerti çerci do çerebello (figua S7, G e H). L’inieçion de l’AAV de contròllo ch’o l’esprimme solo che mCherry (Ctrl-AAV) o no l’à avuo nisciun effetto scignificativo in sciô graddo de neurodegeneraçion inti animæ Mfn2cKO. Pe contra, l’analixi de Mfn2cKO tradute con Mfn2-AAV a l’à mostrou un effetto protettivo scignificativo do seu de çellole PN (figua 4, B e C). Ciù into dettaggio, a denscitæ di neuroin a pâ ëse squæxi indistinguibile da-i animæ de contròllo (figua 4, B e C e figua S7, H e I). L’esprescion de MFN1 ma no de MFN2 a l’é efficaçe o mæximo into sarvâ a mòrte neuronale (figua 4C e figua S7, C e F), cösa ch’a l’indica che l’esprescion de MFN1 ectòpico a peu completâ effettivamente a mancansa de MFN2. Ancon de atre analixi a-o livello de PN sencio an mostrou che Mfn2-AAV o l’à rescatou pe-a ciù parte l’ultrastruttua di mitocondri, o l’à normalizzou i livello de mtDNA e o l’à inversou l’erta esprescion do marcatô antiangiogenexi PCx (figua 4, da C à E). L'ispeçion vixiva di ratti Mfn2cKO sarvæ inte un stato de repòso a l'à mostrou che a seu pòsta e i seu scintomi motori (movimento da S1 à S3) ean megioæ. Pe finî, sti esperimenti demostran che a reintroduçion retardâ de MFN2 inte di PN gravemente carente d’OXPHOS a l’é abasta pe inversâ o consummo de mtDNA e indue l’ateroscleroxi, prevegnindo coscì a degeneraçion di asson e a mòrte di neuroin in vivo.
(A) Un schema ch’o mostra o programma sperimentale pe l’inieçion de AAV ch’o codifica pe MFN2 quande o percorso metabòlico indicou o l’é attivou. (B) Immagine confocale representative de fette do çerebello d’etæ de 12 settemañe tradute à 8 settemañe in sce di ratti Mfn2cKO e marcæ con un anticòrpo anti-calbindiña. A-a drita: a scâ de fibre assoniche. A scâ do zoom di asson a l’é de 450 e 75 μm. (C) À manciña: Quantificaçion da denscitæ de çellole de Purkinje into çiclo de trasduçion AAV (AAV+) (analixi à senso unico da variansa; n = 3 ratti). À drita: analixi do focus mtDNA in PN traduto a-a settemaña 12 (test t no accobiou; n = 6 çellole da trei ratti). * P <0,05; ** P <0,01. (D) Micrografie elettròniche de trasmiscion representative de PN de seçioin çerebellæ Mfn2cKO tradute co-i vettoî virali indicæ. A maschera rossa a l'illustra l'aria occupâ da-i dendriti, e o quaddrou giano pontettou o l'illustra o zoom fornio à drita; n o rappresenta o nucleo. Barra de scâ, 1μm. (E) o mostra un exempio de coloraçion PCx inte PN trasduta à 12 settemañe. Barra de scâ, 20μm. OE, sovraesprescion; FC, cangio de piega.
Pe finî, emmo studiou l’importansa da sopravivensa de çellole induta da-a peroscidaxi inte PN ch’an patio unna disfonçion OXPHOS. Noemme emmo generou mCherry ch’o codifica pe AAV-shRNA (RNA à spilla curta) ch’o l’à mirou into dettaggio à l’mRNA PCx de ratto (AAV-shPCx) e emmo iniettou o virus ò o seu contròllo mescciou (AAV-scr) into çerebello de ratti Mfn2cKO. L’inieçion a l’é stæta fæta inta quarta settemaña d’etæ (figua 5A) pe ottegnî un knockdown effettivo de PCx into periodo donde l’esprescion de PCx a l’é aumentâ (figua 3C) e o seu de çellole PN o l’ea ancon intatto (figua 1A). Va dito che o derruo de PCx (figua S8A) o pòrta à unn’acceleraçion scignificativa da mòrte de PN, ch’a l’é limitâ à l’anello infetto (figua 5, B e C). Pe capî o mecanismo di effetti metabòlichi induti da-a regolaçion in çimma de PCx, emmo studiou o stato redox di PN dòppo o knockdown de PCx e o biosensô òttico mediou da AAV Grx1-roGFP2 o l’é stæto espresso a-o mæximo tempo (figua S8, da-o B a-o D) pe valuâ o glutaçion do peptide relativo3). Dapeu emmo fæto unna microcoscopia d’imaging à fluorescensa à doî fotoin pe tutta a vitta (FLIM) inte de fette ague do çervello de Mfn2cKO de 7 settemañe ò di compagni de niâ de contròllo pe relevâ di cangi potençiali into stato redox citoplasmatico dòppo avei verificou e condiçioin de FLIM (figua S8, E à G). L’analixi a l’à mostrou un aumento scignificativo do stato d’oscidaçion de un scingolo PN Mfn2cKO sensa esprescion de PCx, ch’o l’é despægio da-i neuroin de contròllo ò da-i PN Mfn2cKO ch’esprimman solo che shRNA mescciou (figua 5, D e E). Quande l’esprescion de PCx a l’é stæta regolâ à basso livello, a perçentuale de PN Mfn2cKO che mostravan un stato assæ oscidou a l’é aumentâ de ciù de træ vòtte (figua 5E), cösa ch’a l’indica che a regolaçion in çimma de PCx a mantegniva a capaçitæ redox di neuroin degeneræ.
(A) Un schema ch’o mostra o programma sperimentale pe l’inieçion de AAV ch’o codifica pe shPCx quande o percorso metabòlico indicou o l’é attivou. (B) Fotografie confocale representative de seçioin çerebellæ d’etæ d’8 settemañe in sce di ratti Mfn2cKO traduti e marcæ con un anticòrpo anti-calcineuriña à 4 settemañe. Barra de scâ, 450μm. (C) Quantificaçion da denscitæ de çellole de Purkinje inti çicli traduti da AAV (analixi à senso unico da variansa; n = da 3 à 4 ratti). I dæti son espressi comme media±SEM; ***P<0,001. (D) L’imagine FLIM representativa a mostra a duâ de vitta media de PN de 7 settemañe ch’o l’esprimme o sensô redox do glutation Grx1-roGFP2 inte condiçioin sperimentale speçificæ. Rappòrto LUT (tabella de reçerca): intervallo de tempo de sopravivensa (in picosecondi). Barra de scâ, 25μm. (E) L’istogramma o mostra a distribuçion di valoî da vitta de Grx1-roGFP2 da (D) (n=158 à 368 çellole inte doî ratti inte tutte e condiçioin). O grafico à torno in çimma à ògni istogramma o mostra o numero de çellole con di valoî de duâ de vitta scignificativamente ciù longhi (rosci, oscidæ) ò ciù curti (bleu, reduti), che passan 1 SD do valô medio de duâ de vitta inte CTRL-AAV-scr. (F) O modello propòsto o mostra l’effetto protettivo de l’opregolaçion do PCx neuronale.
Into complescivo, i dæti che fornimmo chì mostran che a reesprescion de MFN2 a peu sarvâ do tutto a PN avansâ con unna grave carensa d’OXPHOS, unna grave depleçion de mtDNA e unna morfologia estremamente anormale ch’a s’assumeggia à l’ista, fornindo coscì un progresso continuo anche inte mouttie avansæ. A neurodegeneraçion a fornisce de preuve reverscibile do stadio primma da mòrte de çellole. Sto graddo de flescibuilitæ metabòlica o l’é enfatizzou ancon de ciù da-a capaçitæ di neuroin d’indue l’ateroscleroxi (un recablaggio do çiclo TCA), ch’o l’inibisce l’esprescion de PCx inte PN sensa OXPHOS e o l’accresce a mòrte de çellole, e donca o zeuga un ròllo de proteçion (figua 5F).
Inte sto studio emmo fornio de preuve che a respòsta di PN a-a disfonçion OXPHOS a l’é de converze pöco à pöco à l’ateroscleroxi do çiclo TCA pe mezo do percorso d’attivaçion differensiale attivou da di programmi metabòlichi. Noemme emmo confermou l’analixi proteòmica con tanti metodi complementäi e emmo revelou che quande vëgnan sfiddæ da unna grave disfonçion mitocondriale, i neuroin an unna forma d’elastiçitæ metabòlica desconosciua primma. Pe nòstra sorpreisa, tutto o proçesso de recablaggio o no marca pe fòrsa o stato metabòlico terminale ch’o l’accompagna a neurodegeneraçion de forma irreverscibile, ma i nòstri dæti suggeriscian ch’o peu formâ un neuron de mantenimento anche into stadio primma da mòrte de çellole Mecanismo de compensaçion fonçionale. Sta descoverta a l’indica che i neuroin an un graddo consciderevole de plastiçitæ metabòlica into còrpo. Sto fæto o demostra che a reintroduçion succesciva de MFN2 a peu inversâ l’esprescion di marcatoî metabòlichi ciave e prevëgnî a degeneraçion de PN. A-o conträio, o l’inibisce l’ateroscleroxi e o l’accelera i nervi. trassessuâ.
Uña de descoverte ciù affascinante da nòstra reçerca a l’é che i PN sensa OXPHOS peuan modificâ o metabolismo do çiclo TCA co-a regolaçion d’enzimi che stimolan into dettaggio l’arterioscleroxi. O redispoxiçion metabòlico o l’é unna caratteristica commun de çellole cançerose, çerte de quæ se basan in sciâ glutamina pe supplementâ i intermedi do çiclo TCA pe produe di equivalenti reduttoî, che guiddan a cadeña respiratöia e mantëgnan a produçion de precursoî de bioscintexi di lipidi e di nucleotidi (39, 40). Un studio fæto de reçente o l’à demostrou che inti tesciui periferichi che patiscian unna disfonçion OXPHOS, a reconnescion do metabolismo glutamina/glutammato a l’é ascì unna caratteristica prominente (5, 41), donde a direçion de l’intrâ da glutamina into çiclo TCA a depende da-a gravitæ da lexon OXPHOS (41). ). À tutti i mòddi, gh’é unna mancansa de preuve ciæe in sce quæ se segge sumeggiansa da plastiçitæ metabòlica neuronale into còrpo e in sciâ seu poscibile relevansa into contesto da mouttia. Inte un studio in vitro fæto de reçente, l’é stæto demostrou che i neuroin corticali primmäi mobilitan de piscine de glutammato pe-a neurotrasmiscion, promeuvendo coscì o metabolismo oscidativo e l’ateroscleroxi inte condiçioin de stress metabòlico (42). Va dito che sotta l’inibiçion farmacològica de l’enzima succinato deidrogenaxi do çiclo TCA, se pensa che a carboscilaçion do piruvato a mantëgne a scintexi de l’ossaloaçetato inti neuroin de granuli do çerebello cortivæ (34). À tutti i mòddi, a relevansa fixològica de sti meccanismi pe-o tesciuo do çervello (donde se pensa che l’ateroscleroxi a segge confinâ pe-o ciù a-i astroçiti) a l’à ancon un scignificato fixològico importante (43). Inte sto caxo, i nòstri dæti mostran che i PN dannezæ da OXPHOS into còrpo peuan vegnî passæ a-a degraddaçion de BCAA e a-a carboscilaçion do piruvato, che son e doe vivagne prinçipæ de supplementaçion di intermedi da piscina TCA. Sciben che l’é stæto propòsto o contributo putativo do catabolismo de BCAA a-o metabolismo de l’energia neuronale, in azzonta a-o ròllo do glutammato e do GABA pe-a neurotrasmiscion (44), no gh’é ancon de preuve de sti meccanismi in vivo. De conseguensa, l’é façile fâ de ipòtexi che i PN disfonçionali pòssan compensâ automaticamente o consummo d’intermedi TCA guiddæ da-o proçesso d’ascimilaçion con l’aumento de l’ateroscleroxi. Ciù into dettaggio, peu ëse neçessäio unn’opregolaçion de PCx pe mantegnî unna domanda aumentâ d’açido aspartico, cösa ch’a se suggerisce inte çellole in proliferaçion con unna disfonçion mitocondriale (45). À tutti i mòddi, a nòstra analixi metabòlica a no l’à revelou di cangi scignificativi into livello de staçionäio de l’açido aspartico inte PN Mfn2cKO (figua S6A), cösa ch’a riflette presummibilmente a diversa utilizzaçion metabòlica de l’açido aspartico tra e çellole proliferante e i neuroin post-mitòtichi. Sciben che o mecanismo esatto de l’opregolaçion de PCx inti neuroin disfonçionali in vivo o l’arresta da caratterizzâ, emmo demostrou che sta respòsta prematura a zeuga un ròllo importante into mantegnî o stato redox di neuroin, cösa ch’a l’é stæta demostrâ inte di esperimenti FLIM in scê fette do çerebello. Ciù into dettaggio, a prevençion a-i PN de regolâ PCx in çimma a peu portâ à un stato ciù oscidou e accelerâ a mòrte de çellole. L’attivaçion da degraddaçion de BCAA e a carboscilaçion do piruvato no en de mainee pe caratterizzâ i tesciui periferichi da disfonçion mitocondriale (7). De conseguensa, pâ che seggian unna caratteristica prioritäia di neuroin con carensa d’OXPHOS, ascì ben che no l’unica caratteristica, ch’a l’é importante pe-a neurodegeneraçion. .
A mouttia do çerebello a l’é unna qualitæ eterogenea de mouttia neurodegenerativa che pe-o sòlito a se manifesta comme atascia e tante vòtte a dannezza i PN (46). Sta popolaçion de neuroin a l’é particolarmente vulnerabile a-a disfonçion mitocondriale perché a seu degeneraçion selettiva inti ratti a l’é abasta pe reprodue tanti di scintomi motoî che caratterizzan l’atascia spinoçerebellâ de l’òmmo (16, 47, 48). Segondo i rappòrti, un modello de ratto trasgenico con un gene mutante o l’é assoçiou à l’atascia spinoçerebellâ de l’òmmo e o l’à unna disfonçion mitocondriale (49, 50), cösa ch’a l’enfatizza l’importansa de studiâ e conseguense da carensa d’OXPHOS inta PNPH. De conseguensa, o l’é particolarmente adatto pe isolâ e studiâ de forma efficaçe sta popolaçion unica de neuroin. À tutti i mòddi, dæto che i PN en assæ senscibili a-a prescion e rappresentan unna bassa proporçion da popolaçion intrega de çellole do çerebello, pe tanti studdi basæ in sce l’òmica, a seu seperaçion selettiva comme çellole intreghe a l’é ancon un aspeto desfiante. Sciben che l’é squæxi imposcibile razzonze unna mancansa assolua de contaminaçion d’atri tipi de çellole (mascime di tesciui adulti), emmo combinou un passo de dissoçiaçion efficaçe co-o FACS pe ottegnî unna quantitæ suffiçiente de neuroin vitæ pe l’analixi proteòmica downstream e avei unna covertua proteica assæ erta (confrontou e proteiñe set de cerexile pöcassæ) (51). Preservando a vitalitæ de çellole intreghe, o metodo che fornimmo chì o ne permette no solo de controllâ i cangi inti percorsci metabòlichi inti mitocondri, ma ascì de controllâ i cangi inte seu controparte citoplasmatiche, cösa ch’a complementa l’utilizzaçion de tag de membrañe mitocondriale pe inricchie o tipo de çellole pe-o tipo de mitocondri. (52, 53). O metodo che descrivemmo o no l’é ligou solo che a-o studio de çellole de Purkinje, ma o peu vegnî applicou de lengê à tutti i tipi de çellole pe affrontâ i cangi metabòlichi into çervello mouttou, compreiso di atri modelli de disfonçion mitocondriale.
Pe finî, emmo identificou un barcon terapeutico durante sto proçesso de redispoxiçion metabòlico ch’o peu inversâ do tutto i segni ciave do stress çellolare e prevëgnî a degeneraçion neuronale. De conseguensa, a comprenscion de implicaçioin fonçionale do recablaggio descrito chì a peu fornî de intuiçioin fondamentale in scî trattamenti poscibili pe mantegnî a vitalitæ neuronale durante a disfonçion mitocondriale. De reçerche d’avvegnî ch’an l’obiettivo de disseçionâ i cangi into metabolismo de l’energia inte di atri tipi de çellole do çervello en neçessäie pe revelâ do tutto l’applicabilitæ de sto prinçipio à de atre mouttie neurològiche.
I ratti MitoPark en stæti descriti primma (31). I ratti C57BL/6N co-i geni Mfn2 che s’attreuvan da-a rente à loxP en stæti descriti in preçedensa (18) e incroxæ con di ratti L7-Cre (23). Dapeu a doggia progenie eterozigöta ch’a ne resultava a l’é stæta incroxâ con di ratti omozigöti Mfn2loxP/Mfn2loxP pe generâ di knockout genichi speçifichi de Purkinje pe Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). Inte un sottoinsemme d’accobiamento, l’allele SorStop-mito-YFP Gt (ROSA26) o l’é stæto introduto pe mezo d’atri incroxi (20). Tutte e proçedue in scê bestie en stæte fæte in conformitæ co-e linie guidda europee, naçionale e instituçionale e approvæ da-a Terra Natua d’Umwelt e da-o Verbraucherschutz, Renania do Nòrd-Vestfalia, Germania. O travaggio in scê bestie o va apreuvo ascì a-e indicaçioin da Federaçion Europea de Assoçiaçioin de Sciense Animæ de Laboratöio.
Dòppo avei anestetizzou a dislocaçion çervicale da dònna incinta, l’embrion de ratto o ven isoou (E13). A cortexa a l’é stæta disseçionâ inte unna soluçion de sâ equilibrâ de Hanks (HBSS) supplementâ con 10 mM d’Epes e a l’é stæta passâ a-o mezzo de l’agogia modificou de Dulbecco ch’o contegniva da papaiña (20 U/ml) e da çisteiña (1 μg/ml). Incubâ o tesciuo inte DMEM) e dissoçiâlo pe mezo da digestion enzimatica. Ml) à 37°C pe 20 menuti e dapeu frenou mecanicamente inte DMEM supplementou co-o særo bovin fetale a-o 10%. E çellole en stæte semenâ in sce di coverti de veddro revestii con de polilisiña à unna denscitæ de 2×106 pe platto de coltua de 6 cm ò à unna denscitæ de 0.5×105 çellole/cm2 pe l’analixi d’imaging. Dòppo 4 oe, o mezzo o l’é stæto sostituio da un mezzo sensa særo Neurobasal ch’o contegniva l’1% de supplemento de B27 e 0.5 mM de GlutaMax. Dapeu i neuroin en stæti mantegnui à 37°C e 5% de CO2 durante tutto l’esperimento e alimentæ unna vòtta pe settemaña. Pe indue a recombinaçion in vitro, 3 μl (platto de coltua con 24 possetti) ò 0.5 μl (placca con 24 possetti) do vetô do virus AAV9 ch’o vëgne apreuvo en stæti deuviæ pe trattâ i neuroin o segondo giorno in vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, numero de catalogo 105530-AAV9) e AAV9 (Addgene, numero de catalogo 105545-AAV9).
O DNA complementare de ratto Mfn1 e Mfn2 (ottegnuo da-o plasmide Addgene n.23212 e n.23213 rispettivamente) o l’é marcou co-a sequensa V5 (GKPIPNPLLGLDST) a-o termine C e o l’é fondou con mCherry into quaddro pe mezo da sequensa T2A. Grx1-roGFP2 o l’é un regâ da-o TP Dick DFKZ de Heidelberg. Sostituindo a cassetta tdTomato pe mezo de metodi de clonaçion convençionali, a cassetta a l’é stæta sottoclonâ inta scheña pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (numero de referensa de l’addgene 28306) pe generâ pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFNGAV-V5. Vettoî FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 e pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2. Unna strategia pægia a l’é stæta deuviâ pe generâ o vettô de contròllo pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Pe generâ o costruto AAV-shPCx l’é neçessäio un vetô AAV plasmidico (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]), ch’o contëgne a sequensa de DNA ch’a codifica pe-o shRNA ch’o mira PCx de ratto (5′ 3′) Sotta o contròllo do promotô U6, mCherry o ven deuviou sotta o contròllo do promotô CMV. A produçion de vettoî AAV ausiliäi a l’é stæta fæta segondo e istruçioin do produttô (Cell Biolabs). Pe dîla curta, deuviâ un plasmide de trasferimento ch’o pòrta mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) trasfeçion transitoria de çellole 2930. (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) ò o gene codificante Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2), coscì comme o gene codificante da proteiña capside AAV1 e o plasmide accessöio de l’imballaggio, pe mezo do metodo do fosfato de calcio. O surnatante gròsso do virus o s’é ottegnuo pe mezo de çicli de zeo-desgheuggise inte un bagno de giassa secca/etanölo e de çellole lisæ inte unna soluçion salina tamponâ con fosfato (PBS). O vettô AAV o l’é stæto purificou con unn’ultraçentrifugaçion discontinua à gradiente de iòdixanölo (24 oe à 32.000 giri/min e 4°C) e o l’é stæto conçentrou pe mezo de un filtro çentrifugo ultra-15 Amicon. O titolo do genöma de AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2,9 × 1013 còpia do genöma (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1 × 1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1 × 1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1 × 1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX o l’é stæto mesuou comme descrito pe-o tempo reale). (qPCR) -MFN1-V5 (1,9 × 1013 GC/ml) e AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9 × 1012 GC/ml).
I neuroin primmäi en stæti rascciæ inte PBS freido comme a giassa 1x, pellettæ e dapeu omogeneizzæ inte un tampon de lixi Triton X-100 à 0.5% / desoscicolato de sòdio/PBS à 0.5% ch’o contegniva fosfataxi e inibitô de proteaxi (Roche). A quantificaçion de proteiñe a l’é stæta fæta pe mezo de l’analixi de l’açido bicinconinico (Thermo Fisher Scientific). Dapeu e proteiñe en stæte separæ pe mezo de l’elettroforexi in sce gel de poliacrilamida SDS e dapeu en stæte marcæ in sce unna membraña de fluoruro de polivinilideno (GE Healthcare). Blocca di sciti no speçifichi e incuba con l’anticòrpo primmäio (s’ammie tabella S1 pe di dettaggi) into 5% de læte inte TBST (salina tamponâ con Tris con Tween), i pasci de lavaggio e l’anticòrpo segondäio inte l’incuba TBST. Incubâ con un anticòrpo primmäio pe tutta a neutte à +4°C. Dòppo o lavaggio, applicâ l’anticòrpo segondäio pe 2 oe à temperatua ambiente. Pe conseguensa, con incubâ o mæximo blot con un anticòrpo anti-β-actiña, s’é confermou o mæximo carrego. Deteçion pe mezo da converscion inte chimiluminescensa e megioamento da chimiluminescensa (GE Healthcare).
I neuroin che in passou ean stæti semenæ in sce di coverti de veddro en stæti fissæ co-o 4% de paraformaldeide (PFA)/PBS into ponto de tempo speçificou à temperatua ambiente pe 10 menuti. E covertue vëgnan permeæ primma con 0.1% de Triton X-100/PBS pe 5 menuti à temperatua ambiente e dapeu inte un tampon de blocco [3% d’albumina særica boviña (BSA)/PBS]. O segondo giorno, e covertue en stæte lavæ con do tampon de blocco e incubæ con l’anticòrpo segondäio coniugou co-o fluoròforo appropiou pe 2 oe à temperatua ambiente; pe finî, i campioin son stæti lavæ ben ben inte PBS co-o 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) ch'o l'é contracolou e dapeu o l'é fissou in sciâ vescicola do microscòpio con Aqua-Poly/Mount.
I ratti (masccio e femina) en stæti anestetizzæ pe mezo de l’inieçion intraperitoneale de ketamina (130 mg/kg) e xilaziña (10 mg/kg) e somministræ sottocutaneamente con un analgesico carprofen (5 mg/kg) e missi inte un strumento stereotattico (Kopd a) con l’equipaggiamento de guæra. Espoñe o cranio e deuvia un travaggio dentäio pe asccianâ a parte da cortexa do çerebello ch’a corresponde à l’òssa mis (da-a lambda: coa 1,8, laterale 1, ch’a corresponde a-i lòboli IV e V). Utilizzâ unn’agoggia de sciringa curva pe creâ con attençion un pertuso piccin into cranio pe schivâ de interrompî a vascolatua de sotta. Dapeu o sottî capillare de veddro tiou o ven inserio a-a lenta into micro-pertuso (da -1,3 à -1 in sciâ banda ventrale da matëia dura) e da 200 à 300 nl de AAV vëgnan iniettæ into microiniettô (Narishige) con de sciringhe manuæ (Narishige) à un periodo de prescion bassa à 10 finestra de menuti. Dòppo l’infuxon, mette o capillare pe atri 10 menuti pe lasciâ che o virus o se spanteghe do tutto. Dòppo che i capillæ en stæti retiæ, a pelle a ven sutua con cua pe redue a-o minimo l’inflamaçion da feria e permette a-o bestio de repiggiâse. E bestie en stæte trattæ con di analgesichi (caspofen) pe ben ben di giorni dòppo l’operaçion, into quæ tempo a seu condiçion fixica a l’é stæta monitorâ con cua e dapeu en stæte eutanasiæ a-o ponto de tempo indicou. Tutte e proçedue son stæte fæte in conformitæ co-e linie guidda europee, naçionale e instituçionæ e son stæte approvæ da-a Terra Natua d'Umwelt e da-o Verbraucherschutz, Renania do Nòrd-Vestfalia, Germania.
E bestie en stæte anestetizzæ con ketamiña (100 mg/kg) e xilaziña (10 mg/kg) e o cheu o l’é stæto perfuso primma con 0.1 M de PBS e dapeu con 4% de PFA in PBS. O tesciuo o l’é stæto disseçionou e fissou inte PFA/PBS a-o 4% pe tutta a neutte à 4°C. Unna taggiascia vibrante (Leica Microsystems GmbH, Vienna, Austria) a l’é stæta deuviâ pe preparâ de seçioin sagittale (drue 50 μm) da-o çervello fisso inte PBS. Delongo che no segge speçificou de mainea despægia, a coloraçion de seçioin à xeuo libero a l’é stæta fæta comme descrito chì de d’ato (13) à temperatua ambiente e con mescciâ. In curta, pe primma cösa, e fette ottegnue en stæte permeabilizzæ co-o 0,5% de Triton X-100/PBS pe 15 menuti à temperatua ambiente; pe çerti epitopi (Pcx e Shmt2), con un tampon tris-EDTA à 80°C (PH 9) rescädâ e fette pe 25 menuti incangio de sto passaggio. Dapeu, e seçioin en stæte incubæ con un anticòrpo primmäio (s’ammie tabella S1) inte un tampon de blocco (3% BSA/PBS) à 4°C pe tutta a neutte con mescciâlo. O giorno apreuvo, e seçioin en stæte lavæ con do tampon de blocco e incubæ con l’anticòrpo segondäio coniugou co-o fluoròforo appropiou pe 2 oe à temperatua ambiente; pe finî, e seçioin en stæte lavæ ben ben inte PBS, contracoloræ con DAPI e dapeu fissæ con AquaPolymount In sce unna vescicola de microscòpio.
Pe representâ o campion l'é stæto addeuviou un microscòpio confocale à scanscion laser (TCS SP8-X ò feuggio de luxe digitale TCS, Microscistemi Leica) fornio con un laser à luxe gianca e un laser à diòdi 405 pe representâ o campion. Con eçitâ o fluoròforo e arrecheugge o segnâ co-o rilevatô ibrido (HyD), o software LAS-X o l'é stæto addeuviou pe arrecheugge de figue impiæ conforme a-o campionamento de Nyquist in modalitæ sequensiale: pe-i pannelli no quantitativi, l'é di segnæ assæ dinamichi (prexempio, inte çellole somatiche e inti dendriti) de UFP Modo BrightR). O gating da 0.3 à 6 ns o ven applicou pe redue o sfondo.
Imaging in tempo reale de çellole ordinæ. Dòppo ëse stæti assortii inte un mezzo Neurobasal-A ch’o contëgne l’1% de supplemento B27 e 0.5 mM de GlutaMax, e çellole en stæte semenâ de botto in sce di vescicoli revestii de poli-l-lisiña (μ-Vesciòtta8 Pozzo, Ibidi, numero de catalogo 80826) , e dapeu l’an mantegnuo à un CO pe stabilîse. L'imaging in tempo reale o l'é stæto fæto in sce un microscòpio confocale à scanscion laser Leica SP8 fornio con un obiettivo à euio laser gianco, HyD, 63×[1,4 apertua numerica (NA)] e un palco de rescädamento.
O ratto o l’é stæto anestetizzou a-a spedia con do bioscido de carbònio e decapitou, o çervello o l’é stæto remposso a-a spedia da-o cranio e o l’é stæto taggiou inte unna seçion sagittale drua de 200 μm (pe l’esperimento d’etichettatua 13C) ò drua de 275 μm (pe doî esperimenti de foton) impia co-i seguenti materiali crece (VHmor50). Scientific, Walldorf, Germania) o l’é impio de sostanse che vëgnan apreuvo: 125 mM freidi comme a giassa, satuæ de carbònio (95% O2 e 5% CO2) basso Ca2 + fluido cerebrospinale artifiçiâ (ACSF) NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampon de sòdio m2, 1,25 mM tampon de sòdio m2, 1,25 mM tampon de sòdio m2, glucòsio, 0,5 mM de CaCl2 e 3,5 mM de MgCl2 (prescion osmòtica da 310 à 330 mmol). Trasferî e fette do çervello ottegnue inte unna camia de preincubaçion ch’a contëgne de Ca2 + ACSF ciù erto (125,0 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM de tampon de fosfato de sòdio, 25,0 mM de NaHCO3, 25,0 mM de d-glucòsio de Ca20 mM, 15,0 mM de d-glucòsio MgCl2) Medio) pH 7,4 e da 310 à 320 mmol).
Into proçesso d'imaging, e fette son stæte mesciæ inte unna stançia dedicâ pe l'imaging e l'esperimento o l'é stæto fæto sotta perfuxon continua de ACSF à unna temperatua costante da 32° à 33°C. Pe l’imaging de fette l’é stæto deuviou un microscòpio à scanscion laser moltifotònico (TCS SP8 MP-OPO, microscistemi Leica) fornio con unna lente oggettiva Leica 25x (NA 0,95, ægua). Mòdolo FLIM (picoharp300, picoquant).
FLIM de Grx1-roGFP2. I cangi into stato redox citoplasmatico di PN en stæti mesuæ da-o FLIM à doî fotoin inte de fette do çervello sagittale, donde o biosensô Grx1-roGFP2 o l’aiva mirou i PN. Into seu PN, o campo d’aquixiçion o ven seleçionou da-i 50 a-i 80 μm pöcassæ sotta a superfiçie da fetta pe fâ de mòddo che ghe segge un PN vitæ (saieiva à dî a mancansa de struttua à perliñe ò di cangi morfològichi neuronali longo i dendriti) e o sensô de contròllo doggio poxitivo roGFP2 e AAVx ch’o codifica mCerexi). Arrecheugge de immagine à unna sola pila con zoom digitale 2x [longhixe d’onda d’eccitaçion: 890 nm; 512 nm 512 pixel]. Deteçion: HyD interno, gruppo de filtro isotioçianato de fluoresceiña (FITC)] e a mediaçion de l’imagine drento de 2 ò 3 menuti vëgnan deuviæ pe fâ de mòddo che vëgne arrecuggeito assæ de fotoin (1000 fotoin into complescivo) pe l’adattamento da curva. A sensibilitæ da sonda Grx1-roGFP2 e a verifica de condiçioin FLIM en stæte fæte monitorando o valô de duâ de vitta de roGFP2 quande s’azzonzeiva H2O2 esogeno 10 mM à l’ACSF de perfuxon (pe mascimizzâ l’oscidaçion, co-o resultato de un aumento da duâ de vitta de reduçion, co-o resultato de unna diminuçion da duâ de vitta) (figua S8, da D à G). Utilizzâ o software FLIMfit 5.1.1 pe analizzâ i exiti ottegnui, adattâ a curva de decadimento esponençiale sencia de l’imagine intrega à l’IRF mesuou (fonçion de respòsta do strumento) e χ2 o l’é pöcassæ 1. Pe carcolâ a duâ de vitta de un scingolo PN, a maschera a l’ea manualmente a duâ de vitta in gio a-o nervo deuviou pe-a quantificaçion.
Analixi do potençiale mitocondriale. Dòppo che a seçion agua a l’é stæta incubâ con 100 nM de TMRM azzonti direttamente à l’ACSF perfuso pe 30 menuti, i cangi de potençiale mitocondriale de PN en stæti mesuæ con un microscòpio à doî fotoin. L’imaging TMRM o l’é stæto fæto con l’eccitaçion da sonda à 920 nm e con deuviâ HyD interno (isotioçianato de tetrametilrodamina: 585/40 nm) pe arrecheugge di segnæ; pe mezo da mæxima longhixe d’onda d’eccitaçion ma pe mezo de un HyD interno despægio (FITC :525/50) pe imaginâ mtYFP. Deuviâ o plug-in Carcolatô d’immagine de ImageJ pe valuâ o potençiale mitocondriale à livello de çellole sencia. À dîla curta, l’equaçion plug-in: segnâ = min (mtYFP, TMRM) a ven deuviâ pe identificâ a region mitocondriale ch’a mostra o segnâ TMRM in somali de Purkinje inte l’imagine confocale à unna pila sencia do cannâ correspondente. Dapeu l’area di pixel inta maschera ch’a ne resulta a ven quantificâ e dapeu a ven normalizzâ in sce l’imagine de livello correspondente à pila sencia do cannâ mtYFP pe ottegnî a fraçion mitocondriale ch’a mostra o potençiale mitocondriale.
L'imagine a l'é stæta desconvolua co-o software Huygens Pro (Immagine scientifica de volumme). Pe-e figue scannerizzæ de tesciue, o montaggio d'unna scingola tesciua o l'é fæto con deuviâ l'algoritmo de cuxitua automatica fornio da-o software LAS-X. Dòppo a taratua de l’imagine, deuviæ ImageJ e Adobe Photoshop pe elaborâ ancon de ciù l’imagine e regolâ de mainea uniforme a lumminoxitæ e o contrasto. Utilizzâ Adobe Illustrator pe-a preparaçion di grafichi.
Analixi do focus do mtDNA. O numero de lexoin de mtDNA o l’é stæto quantificou in scê seçioin do çerebello marcæ con di anticòrpi contra o DNA pe mezo de un microscòpio confocale. Ògni area bersalio a l’é stæta creâ pe-o còrpo de çellole e o nucleo de tutte e çellole e l’area respettiva a l’é stæta carcolâ pe mezo do plug-in Multi Measure (software ImageJ). Sottrae l’area nucleare da l’area do còrpo da çellola pe ottegnî l’area citoplasmatica. Pe finî, o plug-in Analizzâ e partiçelle (software ImageJ) o l’é stæto deuviou pe quantificâ automaticamente i ponti do DNA citoplasmatico ch’indicavan o mtDNA in sce l’imagine de livello e i resultati ottegnui en stæti normalizzæ a-a media PN di ratti CTRL. I resultati en espressi comme quantitæ media de nucleòscidi pe çellola.
Analixi de l’esprescion de proteiñe. Deuviâ o plug-in Carcolatô d’immagine de ImageJ pe valuâ l’esprescion de proteiñe inte PN à livello de çellole sencia. À dîla curta, inte l’imagine confocale à un seu solo do cannâ correspondente, pe mezo de l’equaçion: segnâ = min (mtYFP, anticòrpo), vëgne identificou a region mitocondriale ch’a mostra l’immunoreattivitæ à un çerto anticòrpo à Purkina. Dapeu l’area di pixel inta maschera ch’a ne resulta a ven quantificâ e dapeu normalizzâ in sce l’imagine de livello correspondente à pila sencia do cannâ mtYFP pe ottegnî a fraçion mitocondriale da proteiña mostrâ.
Analixi da denscitæ de çellole de Purkinje. O plug-in Cell Counter de ImageJ o l’é stæto deuviou pe valuâ a denscitæ de Purkinje co-o dividde o numero de çellole de Purkinje contæ pe-a longhixe de l’anello do çerebello occupou da-e çellole contæ.
Preparaçion e recuggeita di campioin. I çervelli do gruppo contròllo e di ratti Mfn2cKO en stæti fissæ inte un tampon fosfou 0,1 M (PB) de PFA a-o 2%/glutaraldeide a-o 2,5% e dapeu en stæte preparæ de seçioin coronale pe mezo de çiliæ (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) (Tampoin de spessore da-o 50 a-o PBn 60). tetrascido e ferroçianuro de potassio à l’1,5% a-a temperatua ambiente pe 1 oa. E seçioin en stæte lavæ træ vòtte con de l'ægua distillâ e dapeu en stæte pittuæ con de l'etanölo a-o 70% ch'o contegniva l'1% d'açetato d'uranilo pe 20 menuti. Dapeu e seçioin en stæte desidratæ inte de l'alcòl graddou e incorporæ inte unna rexiña eposcidica Durcupan ACM (rexiña de fuxon d'araldite M) (Sciense da microcoscopia elettronica, numero de catalogo 14040) tra de vescicole de veddro revestie de siliçio e in sciâ fin à 60°C polimerizzæ into forno48 ours. L’area da cortexa do çerebello a l’é stæta seleçionâ e de seçioin ultrasottî de 50 nm en stæte taggiæ in sce Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) e piggiæ in sce unna grixella de fessue de rammo de 2×1 mm revestia con un film de polistirene. E seçioin en stæte pittuæ con unna soluçion d'açetato d'uranilo a-o 4% inte H2O pe 10 menuti, lavæ con H2O ciù vòtte, dapeu co-o çitrato de ciongio de Reynolds inte H2O pe 10 menuti, e dapeu lavæ con H2O ciù vòtte. E micrografie son stæte piggiæ con un microscòpio elettrònico de trasmiscion Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA) con deuviâ unna macchina fotografica digitale TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, USA). Germania).
Pe-i ratti infetæ da AAV, o çervello o l’é stæto separou e taggiou inte unna seçion sagittale drua de 1 mm e o çerebello o l’é stæto examminou pe mezo de un microscòpio à fluorescensa pe identificâ l’anello infetto da AAV (saieiva à dî ch’o l’esprimme mCherry). Se deuvia solo di esperimenti donde l’inieçion de AAV a resulta inte unn’ertiscima reisa de trasduçion do seu de çellole de Purkinje (saieiva à dî squæxi o seu intrego) a-o manco inte doî anelli çerebellæ consecutivi. O çiclo trasduto da AAV o l’é stæto microdisseçionou pe-a post-fissaçion de neutte (4% de PFA e 2,5% de glutaraldeide inte un tampon de cocao 0.1 M) e dapeu elaborou. Pe l’incorporaçion de EPON, o tesciuo fisso o l’é stæto lavou con 0.1 M de tampon de cacao de sòdio (Applichem) e incubou co-o 2% d’OsO4 (os, Serviçi scientifichi; Caco) inte 0.1 M de tampon de cacao de sòdio (Applichem) pe 4 oe, e dapeu lavou pe 2 oe. Repetî 3 vòtte con un tampon de cocamide 0.1 M. Pe conseguensa, a serie ascendente d’etanölo a l’é stæta deuviâ pe incubâ tutte e soluçioin d’etanölo à 4°C pe 15 menuti pe desidrattâ o tesciuo. O tesciuo o l’é stæto trasferio inte l’òscido de propilene e incubou pe tutta a neutte inte EPON (Sigma-Aldrich) à 4°C. Mette o tesciuo inte un neuvo EPON à temperatua ambiente pe 2 oe, e dapeu incorporâlo à 62°C pe 72 oe. Deuviâ un ultramicròtomo (Leica Microsystems, UC6) e unna taggiascia à diamante (Diatome, Biel, Svissera) pe taggiâ de seçioin ultrasottî de 70 nm, e pittuâ con de l’açetato d’uranilo à l’1,5% pe 15 menuti à 37°C, e pittuâ con unna soluçion de çitrato de ciongio pe 4 menuti. I micrografi elettrònichi son stæti piggiæ con deuviâ un microscòpio elettrònico à trasmiscion JEM-2100 Plus (JEOL) fornio de unna telecamera OneView 4K à 16 bit (Gatan) e un programma de micrografia digitale (Gatan). Pe l'analixi, l'é stæto ottegnuo di micrografi elettrònichi con un zoom digitale de 5000 ò 10.000×.
Analixi morfològica di mitocondri. Pe tutte e analixi, e linie di scingoli mitocondri en stæte deliniæ à man inte de figue digitale pe mezo do software ImageJ. Vegnan analizzæ diversci parametri morfològichi. A denscitæ di mitocondri a l’é espressa comme perçentuale ottegnua co-a divixon de l’area mitocondriale totale de tutte e çellole pe l’area do citoplasma (area do citoplasma = area de çellola-area do nucleo de çellola) × 100. A riondoxitæ di mitocondri a ven carcolâ co-a formola [4π∙2(area)]./perimetro. A morfologia ista di mitocondri a l’é stæta analizzâ e scompartia inte doe categorie («tubolare» e «vescica») segondo e seu forme prinçipæ.
Analixi do numero d’autofagosömi/lisosömi e da denscitæ. Deuviâ o software ImageJ pe deliniâ à man e linie de tutti i autofagosömi/lisosömi inte l’imagine digitale. L’area de l’autofagosöma/lisosöma a l’é espressa comme perçentuale carcolâ co-a divixon de l’area totale da struttua de l’autofagosöma/lisosöma de tutte e çellole pe l’area do citoplasma (area do citoplasma=area da çellola-area do nucleo) × 100. A denscitæ di autofagosömi/lisosömi a ven carcolâ dividdendo o numero totale pe-a quantitæ de struttue autofagosömi/lisosömi pe çellola (in termini d’area citoplasmatica) (area citoplasmatica = area çellolare-area nucleare).
Etichettatua pe-a seçion agua e a preparaçion do campion. Pe-i esperimenti che domandan l’etichettatua de glucòsio, trasferî e fette do çervello aguo inte unna camia de preincubaçion, ch’a contëgne do carbònio satou (95% O2 e 5% de CO2), erto Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampon de sòdio m3O, 1,25 mM fosfato de sòdio. 25,0 mM de d-glucòsio, 1,0 mM de CaCl 2 e 2,0 mM de MgCl 2, regolæ à pH 7,4 e da 310 à 320 mOsm), donde o glucòsio o l’é 13 C 6- sostituçion de glucòsio (Eurisotop, numero de catalogo CLM9-1). Pe-i esperimenti che domandan l’etichettatua de piruvato, trasferî e fette do çervello aguo inte un Ca2 + ACSF ciù erto (125,0 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM de tampon de fosfato de sòdio, 25,0 mM de NaHCO3, 25,0 mM de d-glucòsio Ad2C e m1 MgCl2, regolâ a-o pH 7,4 e 310 à 320 mOsm) e azzonze 1 mM de piruvato 1-[1-13C] (Eurisotop, numero de catalogo CLM-1082). Incubâ e seçioin pe 90 menuti à 37°C. In sciâ fin de l'esperimento, e seçioin en stæte lavæ a-a spedia con unna soluçion aquosa (pH 7,4) ch'a contegniva 75 mM de carbonato d'ammonio e dapeu omogeneizzæ inte l'açetonitrilo (ACN) à 40:40:20 (v:v:v): metanòlo: ægua. Dòppo che e seçioin son stæte incubæ in sciâ giassa pe 30 menuti, i campioin son stæti centrifugæ à 21.000 g pe 10 menuti à 4°C e o sorvenatante ciæo o l'é stæto asciugou inte un conçentratô SpeedVac. O pellet de metabolito secco ch’o ne resultava o l’é stæto conservou à -80°C fin à l’analixi.
Analixi de cromotografia liquida-spettrometria de massa de 13 aminoaçidi marcæ con C. Pe l’analixi de cromotografia liquida-spettrometria de massa (LC-MS), o pellet de metabòlito o l’é stæto misso torna in sospenscion inte 75 μl d’ægua de qualitæ LC-MS (Honeywell). Dòppo a centrifugaçion à 21.000 g pe 5 menuti à 4°C, 20 μl do sorvenatante scciæio en stæti deuviæ pe l’analixi do flusso d’aminoaçidi, mentre o resto de l’estratto o l’é stæto deuviou de botto pe l’analixi aniònica (s’ammie ciù avanti). L’analixi di aminoaçidi a l’é stæta fæta pe mezo do protocòllo de derivatizzaçion do cloruro de benzoilo descrito in passou (55, 56). Into primmo passo, 10 μl de carbonato de sòdio 100 mM (Sigma-Aldrich) en stæti azzonti à 20 μl d’estratto de metabòlito e dapeu 10 μl de cloruro de benzoilo a-o 2% (Sigma-Aldrich) en stæti azzonti à l’ACN de qualitæ LC. O campion o l'é stæto vortexou pe pöco tempo e dapeu çentrifugou à 21.000 g pe 5 menuti à 20°C. Trasferî o sorvenatante nettezzou inte unna fiala d'autocampionamento de 2 ml con un inserto de veddro cònico (200 μl de volumme). I campioin son stæti analizzæ con deuviâ o scistema LC à erta prestaçion (Waters) de Acquity iClass collegou a-o spettrometro de massa à erta resoluçion (Thermo Fisher Scientific). Pe l'analixi, 2 μl do campion derivou son stæti iniettæ inte unna chinòlla de silice T3 à erta rescistensa de 100×1,0 mm (Waters) ch'a contegniva de partiçelle de 1,8 μm. O tasso de portâ o l’é de 100μl/min e o scistema tampon o consciste inte un tampon A (10 mM de formato d’ammonio e 0.15% d’açido fòrmico inte l’ægua) e into tampon B (ACN). O gradiente o l’é o seguente: 0%B à 0 menuti; 0%B. da-o 0 a-o 15% B da-o 0 a-o 0,1 menuti; 15 à 17% B à 0,1 à 0,5 menuti; B a-o 17 a-o 55% a-i 0,5 a-i 14 menuti; B a-o 55 a-o 70% a-i 14 a-i 14,5 menuti; a-o 14,5 a-o 70 a-o 100% B a-i 18 menuti; 100% B a-i 18 a-i 19 menuti; 100 a 0% B a-i 19 a-i 19,1 menuti; 0% B da-i 19,1 a-i 28 menuti (55, 56). O spettrometro de massa QE-HF o fonçioña in modalitæ de ionizzaçion poxitiva con un intervallo de massa da m/z (rappòrto massa/carrega) da 50 à 750. A resoluçion applicâ a l’é de 60.000, e o bersalio de ioin de contròllo do guägno (AGC) ottegnuo o l’é de 3×106, e o tempo mascimo de ioin o l’é de milli0se1. A vivagna d'ionizzaçion à elettrospray rescädâ (ESI) a fonçioña à unna tenscion de spray de 3,5 kV, unna temperatua capillâ de 250°C, un flusso d'äia guaiña de 60 AU (unitæ arbiträie) e un flusso d'äia ausiliäio de 20 AU. 250°C. A lente S a l’é impostâ in sce 60 AU.
Analixi cromotografia aniònica-MS d’açidi organichi marcæ con 13C. O preçipito de metabòlito ch’o l’arresta (55μl) o l’é stæto analizzou pe mezo de un scistema de cromotografia iònica Dionex (ICS 5000+, scientifico termofisher) collegou à un spettrometro de massa QE-HF (termofisher scientifico). In curta, 5μl d’estratto de metabolito en stæti iniettæ inte unna chinòlla Dionex IonPac AS11-HC fornia con HPLC (2 mm×250 mm, dimenscion de partiçelle 4μm, Thermo Fisher Scientific) in modalitæ à çiclo parçiale push-in con un rappòrto de riempimento de 1. 4μm, scientifico termofisher). A temperatua da chinòlla a se mantëgne à 30°C e l'autocampionatô o l'é misso à 6°C. Deuviâ unna cartuccia d’idròscido de potassio fornia con de l’ægua deionizzâ pe generâ un gradiente d’idròscido de potassio pe mezo do generatô d’eluente. Separaçion di metaboliti à un tasso de portâ de 380μl/min, con applicâ o seguente gradiente: da 0 à 3 menuti, 10 mM KOH; da 3 à 12 menuti, da 10 à 50 mM de KOH; da 12 à 19 menuti, da 50 à 100 mM de KOH; 19 à 21 menuti , 100 mM de KOH; 21 à 21,5 menuti, da 100 à 10 mM de KOH. A chinòlla a l'é stæta torna equilibrâ sotta 10 mM KOH pe 8,5 menuti.
I metaboliti eluii vëgnan combinæ con un flusso de supplemento d’isopropanölo de 150 μl/min dòppo a chinòlla e dapeu vëgnan diretti à un spettrometro de massa à erta resoluçion ch’o fonçioña in modalitæ d’ionizzaçion negativa. MS o l’é apreuvo à monitorâ l’intervallo de massa da m/z 50 à 750 con unna resoluçion de 60.000. L’AGC o l’é impostou in sce 1×106 e o ​​tempo mascimo di ioin o l’é mantegnuo à 100 ms. A vivagna ESI rescädâ a l'ea açionâ à unna tenscion de spray de 3,5 kV. E atre impostaçioin da vivagna de ioin son e seguente: temperatua capillare 275°C; flusso de gas guaiña, 60 AU; flusso de gas ausiliäio, 20 AU à 300°C, e l’impostaçion da lente S à 60 AU.
Analixi di dæti di metaboliti marcæ con 13C. Pe l’analixi di dæti do rappòrto isòtopi, deuviæ o programma TraceFinder (verscion 4.2). L’identitæ de tutti i compòsti a l’é stæta verificâ da un compòsto de referensa seguo e analizzâ de forma independente. Pe fâ l’analixi d’inricchimento di isòtopi, l’area do cromatogramma ionico estræto (XIC) de tutti i isòtopi 13C (Mn) a l’é stæta estræta da [M + H] +, donde n o l’é o numero de carbònio do compòsto bersalio, deuviou pe analizzâ i aminoaçidi ò [ MH] + deuviou pe analizzâ i anioin. A preçixon de massa de XIC a l’é ciù bassa de çinque parte pe mioin e a preçixon de RT a l’é de 0.05 menuti. L’analixi d’inricchimento a ven fæta co-o carcolo do rappòrto tra tutti i isòtopi relevæ e a somma de tutti i isòtopi do compòsto correspondente. Sti rappòrti en dæti comme valoî perçentuali pe ògni isòtopo e i resultati en espressi comme inricchimento perçentuale molare (MPE), comme descrito primma (42).
O pellet de neuroin zeou o l’é stæto omogeneizzou inte do metanölo freido comme a giassa à l’80% (v/v), vortexou e incubou à -20°C pe 30 menuti. Vortexâ torna o campion e mescciâ à +4°C pe 30 menuti. O campion o l'é stæto centrifugou à 21.000 g pe 5 menuti à 4°C e dapeu o sorvenatante ch'o ne sciortiva o l'é stæto arrecuggeito e asciugou con deuviâ un conçentratô SpeedVac à 25°C pe unn'analixi succesciva. Comme l’é stæto descrito chì de d’ato, l’analixi LC-MS a l’é stæta fæta in scî aminoaçidi de çellole assortiæ. Pe mezo de TraceFinder (verscion 4.2, scientifico Thermo Fisher), l’analixi di dæti a l’é stæta fæta pe mezo da massa monoisòtopa de tutti i compòsti. A normalizzaçion quantile di dæti di metabòliti a l’é stæta fæta pe mezo do pacchetto software preproçessoCore (57).
Preparaçion de fette. O ratto o l’é stæto anestetizzou a-a spedia con do bioscido de carbònio e decapitou, o çervello o l’é stæto remposso a-a spedia da-o cranio e a taggiascia vibrante pinna de giassa (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germania) a l’é stæta deuviâ pe taggiâlo inte 300 à 375 μm de carbònio. CO2) Basso Ca2 + ACSF (125,0 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM de tampon de fosfato de sòdio, 25,0 mM de NaHCO3, 25,0 mM de d-glucòsio, 1,0 mM de CaCl2 e 6,0 mM de MgCl30. mOsmo). Trasferî e fette de çervello ottegnue inte unna camia ch’a contëgne un Ca2 + ACSF ciù erto (125,0 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM de tampon fosfato de sòdio, 25,0 mM de NaHCO3, 25,0 mM de d-glucòsio pH22 e 4,0 mM de Ca32l mM. e da 310 à 320 mOsm). Conservâ e fette pe 20 à 30 menuti de mòddo che pòssan ëse restöræ avanti de registrâle.
registraçion. Pe tutte e registraçioin l'é stæto addeuviou un parco de microscòpio fornio con unna camia de registraçion fissa e unna lente oggettiva à immerscion inte l'ægua 20 vòtte (Scientifica). E çellole putative de Purkinje en stæte identificæ da-a (i) dimenscion do còrpo, (ii) da-a poxiçion anatòmica do çerebello e (iii) da l’esprescion do gene reporter fluorescente mtYFP. A pipetta à pertuso con unna rexistensa de ponta da 5 à 11 megohm a ven tiâ feua da un capillare de veddro borosilicato (GB150-10, 0,86 mm×1,5 mm×100 mm, produti da sciensa, Hofheim, Germania) e da unna pipetta orizzontale. Tutte e registraçioin en stæte fæte da l'amplificatô de morsa npi ELC-03XS (GmbH elettrònico npi, Tam, Germania), ch'o l'ea controllou da-o programma Signal (verscion 6.0, Cambridge Electronic, Regno Unio). L'esperimento o l'é stæto registrou con unna lestixe de campionamento de 12,5 kHz. O segnâ o ven filtrou con doî filtri Bessel à passaggio curto con de frequense de taggio de 1,3 e 10 kHz rispettivamente. A capaçitæ da membraña e da pipetta a ven compensâ da-o çircuito de compensaçion ch’o deuvia l’amplificatô. Tutti i esperimenti son stæti fæti sotta o contròllo de unna telecamera Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Germania, Germania), ch'a l'ea controllâ da-o programma Hokawo (verscion 2.8, Germania, Germania).
Configuraçion e analixi de routine de çellole intreghe. Subito avanti da registraçion, impie a pipetta co-a soluçion interna ch’a contëgne e sostanse seguente: 4,0 mM de KCl, 2,0 mM de NaCl, 0,2 mM de EGTA, 135,0 mM de gluconato de potassio, 10,0 mM de Hepes, 4,0 mM de trifonoTPGsiña (4,0 mM de ATP.TPG5M) (Na) e 10,0 mM de fosfato de creatiniña en stæti regolæ à pH 7,25 e a prescion osmòtica a l’ea de 290 mOsm (saccaròsio). Subito dòppo avei applicou unna fòrsa de 0 pA pe rompî a membraña, s’é mesuou o potençiale da membraña à repòso. A rexistensa d’intrâ a ven mesuâ con applicâ de corrente iperpolarizzæ de -40, -30, -20 e -10 pA. Mesua l’entitæ da respòsta de tenscion e deuvia a lezze d’Ohm pe carcolâ a rexistensa d’input. L'attivitæ spontanea a l'é stæta registrâ inte unna morsa de tenscion pe 5 menuti e o sPSC o l'é stæto identificou e mesuou inte Igor Pro (verscion 32 7.01, WaveMetrics, Lago Oswego, Oregon, Stati Unii) pe mezo de un script de reconoscimento semiautomàtico. A curva IV e a corrente à staçionäio vëgnan mesuæ con serrâ a batteria à di potensiæ despægi (à partî da -110 mV) e aumentâ a tenscion inte di pasci de 5 mV. A produçion de AP a l’é stæta verificâ con applicâ unna corrente depolarizzante. Serrâ a çellola à -70 mV tanto ch’applica un impulso de corrente depolarizzante. Regolâ a dimenscion do passo de ògni unitæ de registraçion pe conto seu (da 10 à 60 pA). Carcolâ a frequensa mascima AP contando manualmente i picchi d’impulso che pròvocan a frequensa AP ciù erta. O livello de AP o ven analizzou pe mezo do segondo derivou de l’impulso de depolarizzaçion ch’o l’attiva pe-a primma vòtta un ò ciù AP.
Configuraçion e analixi do patch perforou. Exeguî a registraçion de patch perforæ pe mezo de protocòlli standard. Utilizzâ unna pipetta sensa ATP e GTP ch’a no contëgne i ingredienti seguenti: 128 mM de gluconato K, 10 mM de KCl, 10 mM de Hepes, 0,1 mM de EGTA e 2 mM de MgCl2, e regolâla a-o pH 7,2 (pe mezo de KOH). ATP e GTP vëgnan ometti da-a soluçion intraçellolare pe prevëgnî a permeabilitæ incontrollâ da membraña çellolare. A pipetta de pertuso a ven impia con unna soluçion interna ch’a contëgne de l’anfoteriçiña (da 200 à 250 μg/ml pöcassæ; G4888, Sigma-Aldrich) pe ottegnî un registro de pertuso perforou. L’anfoteriçiña a l’é stæta deslenguâ inte un sorfòscido de dimetil (conçentraçion finale da-o 0,1 a-o 0,3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). A conçentraçion de DMSO deuviâ a no l’à avuo nisciun effetto scignificativo in scî neuroin studiæ. Into proçesso de perforaçion, a rescistensa do cannâ (Ra) a l'é stæta monitorâ delongo e l'esperimento o l'é stæto comensou dòppo che l'ampiessa de Ra e AP a s'é stabilizzâ (20-40 menuti). L'attivitæ spontanea a ven mesuâ inte unna morsa de tenscion e/ò de corrente pe 2 à 5 menuti. L’analixi di dæti a l’é stæta fæta pe mezo de Igor Pro (verscion 7.05.2, WaveMetrics, Stati Unii), Excel (verscion 2010, Redmond, Stati Unii) e GraphPad Prism (verscion 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, California). Stati Unii). Pe identificâ di AP spontanei se deuvia o plug-in NeuroMatic v3.0c de IgorPro. Identificâ automaticamente i AP pe mezo de un livello determinou, ch'o vëgne regolou de pe lê pe ògni record. Pe mezo de l’intervallo de ponta, determinâ a frequensa de ponta co-a frequensa mascima de ponta istantanea e a frequensa media de ponta.
Isolamento PN. Adattandose a-o protocòllo pubricou in passou, i PN en stæti purificæ da-o çerebello do ratto inte un stadio speçificou (58). In curta, o çerebello o l’é stæto disseçionou e tritou inte un mezzo de dissoçiaçion freido comme a giassa [sensa HBSS Ca2+ e Mg2+, supplementou con 20 mM de glucòsio, penicilliña (50 U/ml) e streptomiçiña (0,05 mg/ml)], e dapeu o l’é stæto digerio o mezzo con mgHSS1-scisteiña [ / ml), papaiña (16 U / ml) e desosciribonucleaxi I (DNaxi I; 0,1 mg/ml)] Trattâ pe 30 menuti à 30°C. Pe primma cösa lavâ i tesciui inte un mezzo HBSS ch’o contëgne do muco d’euvio (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) e UNaxi (0,1 mg/ml) à temperatua ambiente pe prevegnî a digestion enzimatica, e dapeu inte un mezzo HBSS ch’o contëgne 20 mM de glucòsio, con moî delicatamente inte HBmiçiña/HBmiçiña (0,05 mg/ml) e a DNaxi (0,1 mg/ml) relascian de çellole sence. A sospenscion de çellole ch’a ne resultava a l’é stæta filtrâ pe mezo de un filtro de çellole de 70 μm, dapeu e çellole en stæte pellettæ pe centrifugaçion (1110 giri/min, 5 menuti, 4°C) e resuspeise inte un mezzo de classificaçion [HBSS, supplementou con 20 mM de glucòsio, 20% de stremiçiña boviña fetale) Sêro, (0,05 mg/ml)]; valuâ a vitalitæ de çellole co-o iòduro de propidio e regolâ a denscitæ de çellole da 1×106 à 2×106 çellole/ml. Avanti da citometria à flusso, a sospenscion a vegniva filtrâ pe mezo de un filtro de çellole de 50 μm.
Citòmetro de flusso. A classificaçion de çellole a l’é stæta fæta à 4°C pe mezo da machina FACSAria III (BD Biosciences) e do software FACSDiva (BD Biosciences, verscion 8.0.1). A sospenscion de çellole a l’é stæta organizzâ pe mezo de un bozzetto de 100 μm sotta unna prescion de 20 psi à unna lestixe de ~2800 eventi/sec. Dæto che i critëi tradiçionali de gating (dimenscion de çellole, discriminaçion bimodale e caratteristiche de diffuxon) no peuan garantî o corretto isolamento de PN da di atri tipi de çellole, a strategia de gating a l’é stabilia in sciâ base do confronto diretto de l’intensitæ YFP e de l’autofluorescensa into mitoYFP+ ​​e into mitoYFP de contròllo. YFP o l'é eçitou con irradiâ o campion con unna linia laser de 488 nm e o segnâ o vëgne individuou pe mezo de un filtro passa-banda de 530/30 nm. Inti ratti mitoYFP+, a fòrsa relativa do gene reporter mitoYFP Rosa26 a ven deuviâ ascì pe distingue di frammenti de còrpo neuronale e asson. 7-AAD o l’é eçitou con un laser giano à 561 nm e o l’é relevou con un filtro passa-banda de 675/20 nm pe escludde e çellole mòrte. Pe separâ i astroçiti into mæximo tempo, a sospenscion de çellole a l'é stæta colorâ con ACSA-2-APC, dapeu o campion o l'é stæto irradiou con unna linia laser de 640 nm e un filtro passa-banda de 660/20 nm o l'é stæto addeuviou pe relevâ o segnâ.
E çellole arrecuggeite en stæte pellettæ pe centrifugaçion (1110 rpm, 5 menuti, 4°C) e conservæ à -80°C fin à l’utilizzaçion. I ratti Mfn2cKO e i seu figgeu da niâ vëgnan clascificæ o mæximo giorno pe redue a variabilitæ de proçedua a-o minimo. A presentaçion e l'analixi di dæti FACS son stæte fæte con deuviâ o programma FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, Stati Unii).
Comme l’é stæto dito primma (59), a PCR in tempo reale a ven deuviâ pe isolâ o DNA da-i neuroin spartii pe-a quantificaçion do mtDNA succesciva. A-o comenso a linearitæ e a sensibilitæ a-o livello en stæte verificæ con exeguî qPCR in sce unna quantitæ differente de çellole. In curta, arrecheugge 300 PN inte un tampon de lixi ch’o consciste de 50 mM de tris-HCl (pH 8,5), 1 mM de EDTA, 0,5% de Tween 20 e proteiñaxi K (200 ng/ml) e incubâ à 55°C pe 120 menuti. E çellole en stæte incubæ ancon à 95°C pe 10 menuti pe garantî l’inattivaçion completa da proteiñaxi K. Pe mezo de unna sonda TaqMan (Thermo Fisher) speçifica pe mt-Nd1, o mtDNA o l’é stæto mesuou pe mezo de PCR semiquantitativa into scistema PCR in tempo reale 7900HT. Sciensa, numero de catalogo Mm04225274_s1), geni mt-Nd6 (termofisher, numero de catalogo AIVI3E8) e 18S (termofisher, numero de catalogo Hs99999901_s1).
Preparaçion do campion de proteöma. Rescädando a soluçion à 95°C pe 10 menuti e sonicando, into tampon de lixi [6 M de cloruro de guanidiña, 10 mM de cloruro de tris(2-carbossetil) fosfiña, 10 mM de cloroacetamida e 100 mM de pellet de tris-HC in neuron zeou]. In sce Bioruptô (Diagenòdo) pe 10 menuti (30 segondi de impulso / 30 segondi de periodo de pausa). O campion o l'é stæto diluio 1:10 inte 20 mM de tris-HCl (pH 8,0), mescciou con 300 ng d'öo de tripsiña (Promega) e incubou pe tutta a neutte à 37°C pe ottegnî unna digestion completa. O segondo giorno, o campion o l'é stæto centrifugou à 20.000 g pe 20 menuti. O sorvenatante o l’é stæto diluio con de l’açido formico a-o 0.1% e a soluçion a l’é stæta desalâ con di StageTips autoproduti. O campion o l'é stæto asciugou inte un strumento SpeedVac (conçentratô Eppendorf ciù 5305) à 45°C e dapeu o peptide o l'é stæto sospeiso inte l'açido formico a-o 0,1%. Tutti i campioin son stæti inandiæ a-o mæximo tempo da-a mæxima persoña. Pe analizzâ di campioin d’astroçiti, 4 μg de peptidi dessalæ en stæti marcæ con un marco de massa in tandem (TMT10plex, numero de catalogo 90110, Thermo Fisher Scientific) con un rappòrto peptido/reagente TMT de 1:20. Pe-a marcatua TMT, 0.8 mg de reagente TMT en stæti missi torna in sospenscion inte 70 μl de ACN anidro e o peptide secco o l’é stæto reconstituio inte 9 μl de TEAB 0.1 M (bicarbonato de trietilammònio), a-o quæ s’é azzonto 7 μl de reagente TMT inte ACN. A conçentraçion a l'ea do 43,75%. Dòppo 60 menuti d’incubaçion, a reaçion a l’é stæta asmortâ con 2 μl d’idròscilamina a-o 5%. I peptidi marcæ en stæti recuggeiti, secchi, resuspeisi inte 200 μl d’açido formico (FA) a-o 0.1%, scompartii inte doî e dapeu dessalæ pe mezo de StageTips autoproduti. Pe mezo do cromatografo liquido à erta prestaçion UltiMate 3000 (cromatografo liquido à erta prestaçion UltiMate 3000), uña de doe meitæ a l’é stæta fraçionâ in sce unna chinòlla cromotografica Acquity de 1 mm x 150 mm pinna de partiçelle C18 de 130Å1,7 μm (No. Termopescatô scientifico). Separâ di peptidi à un tasso de portâ de 30μl/min, separâ da l’1% a-o 50% de tampon B pe 85 menuti con un gradiente passo à passo de 96 menuti, da-o 50% a-o 95% de tampon B pe 3 menuti, dapeu 8 menuti pe-o 95% de tampon B; O tampon A o l’é 5% de ACN e 10 mM bicarbonato d’ammonio (ABC), e o tampon B o l’é 80% ACN e 10 mM ABC. Arrecheugge de fraçioin ògni 3 menuti e mescciâle inte doî gruppi (1 + 17, 2 + 18, etc.) e asciugâle inte unna centrifuga à veuo.
Analixi LC-MS/MS. Pe-a spettrometria de massa, i peptidi (numero r119.aq) en stæti separæ in sce unna chinòlla d’analixi PicoFrit de 25 cm e 75 μm de diametro interno (neuva lente oggettiva, numero de parte PF7508250) fornia de 1,9 μm de mezo ReproSil-Cr1D-Cr120). EASY-nLC 1200 (termopescatô scientifico, Germania). A chinòlla a l'é stæta mantegnua à 50°C. I tampoin A e B en 0.1% d’açido formico inte l’ægua e 0.1% d’açido formico inte l’80% de ACN rispettivamente. I peptidi en stæti separæ da-o 6% a-o 31% de tampon B pe 65 menuti e da-o 31% a-o 50% de tampon B pe 5 menuti con un gradiente de 200 nl/min. I peptidi elui en stæti analizzæ in sce un spettrometro de massa à fuxon Orbitrap (scientifico Thermo Fisher). A mesuaçion do precursô peptidico m/z a se fa con unna resoluçion de 120.000 inte l’intervallo da 350 à 1500 m/z. Pe mezo de l’energia de collixon normalizzâ do 27%, o precursô ciù fòrte con un stato de carrega da-o 2 a-o 6 o ven seleçionou pe-a scission da dissoçiaçion da trappoa C à erta energia (HCD). O tempo de çiclo o l’é fissou in sce 1 s. O valô m/z do frammento peptidico o l’é stæto mesuou inta trappoa ionica pe mezo do bersalio AGC ciù piccin de 5×104 e o tempo d’inieçion mascimo de 86 ms. Dòppo a frammentaçion, o precursô o l’é stæto misso inta lista d’escluxon dinamica pe 45 s. I peptidi marcæ con TMT en stæti separæ in sce unna chinòlla PepMap de 50 cm e 75 μm. (FAIMS) (Thermo Fisher Scientific) o fonçioña à doe tenscioin de compensaçion de -50 e -70 V. MS3 seleçionou in sciâ base do precursô de scincronizzaçion o vëgne deuviou pe-a mesuaçion do segnâ iònico do rappòrto TMT. A seperaçion di peptidi a l’é stæta fæta in sce EASY-nLC 1200, pe mezo de unn’eluçion à gradiente lineare do 90%, con unna conçentraçion de tampon da-o 6% a-o 31%; o tampon A o l’ea 0,1% de FA e o tampon B o l’ea 0,1% FA e 80% ACN. A chinòlla d'analixi a l'é fonçionâ à 50°C. Utilizzâ FreeStyle (verscion 1.6, scientifico termofisher) pe dividde o file originâ in sciâ base da tenscion de compensaçion FAIMS.
Identificaçion e quantificaçion de proteiñe. Pe mezo do motô de reçerca Andròmeda intregou, i dæti originali en stæti analizzæ pe mezo da verscion 1.5.2.8 de MaxQuant. In azzonta a-e sequense de recombinaxi Cre e YFP ottegnue da Aequorea victoria, l’é stæto reçercou di spettri de frammenti peptidichi pe-a sequensa canònica e a sequensa isoforma do proteöma de referensa do ratto (ID do proteöma UP000000589, telecargou da UniProt do mazzo do 2010). L’oscidaçion da metioniña e l’açetilaçion N-terminale da proteiña en stæte definie comme modifiche variabile; a metilaçion da cisteiña carbamoilo a l’é stæta definia comme modifiche fisse. I parametri de digestion en impostæ in sce «speçificitæ» e «tripsiña/P». A quantitæ minima de peptidi e peptidi de rasô deuviæ pe l’identificaçion de proteiñe a l’é 1; o numero minimo de peptidi unichi o l’é 0. Inte condiçioin de correspondensa de mappe peptidiche, o tasso d’identificaçion de proteiñe o l’ea de 0.01. L’opçion “Segondo peptide” a l’é attivâ. Utilizzâ l’opçion “correspondensa tra execuçioin” pe trasmette de identificaçioin de successo tra di file originali despægi. Utilizzâ o rappòrto minimo LFQ numero 1 pe-a quantificaçion sensa etichetta (LFQ) (60). L’intensitæ de LFQ a ven filtrâ a-o manco pe doî valoî validi inte un gruppo de genotipo a-o manco inte tutti i ponti de tempo e a ven estrapolâ da unna distribuçion normale con unna larghessa de. 0.3 e mesciâse verso o basso 1.8. Utilizzâ a piattaforma de computing Perseus e R pe analizzâ i exiti do LFQ. Un test t moderou à doî sensci da-o pacchetto software limma o l’é stæto addeuviou pe l’analixi d’esprescion differensiale (61). L'analixi di dæti d'esploraçion a ven fæta pe mezo de ggplot, FactoMineR, fattoextra, GGally e pheatmap. I dæti de proteòmica basæ in sce TMT en stæti analizzæ pe mezo da verscion 1.6.10.43 de MaxQuant. Çercâ di dæti proteòmichi gròsci da-a base de dæti de proteòmica umaña de UniProt, ch’a l’é stæta telecargâ do settembre do 2018. L’analixi a comprende o fattô de correçion da puritæ di isòtopi fornio da-o produttô. Deuviâ o limma inte R pe l’analixi d’esprescion differensiale. I dæti originali, i exiti da reçerca in sciâ base de dæti e o flusso de travaggio e i exiti de l'analixi di dæti son tutti inmaganizzæ inte l'alliansa ProteomeXchange pe mezo do archivio de partenæ PRIDE con l'identificatô de l'insemme de dæti PXD019690.
E annotaçioin fonçionale inricchiscian l’analixi. O strumento d'analixi do percorso d'ingegno (QIAGEN) o l'é stæto addeuviou pe determinâ a ricchessa di termini d'annotaçion fonçionale de l'insemme de dæti à 8 settemañe (figua 1). À dîla curta, a lista quantitativa de proteiñe ottegnua da l’analixi di dæti LC-MS/MS (spettrometria de massa in tandem) a ven deuviâ co-i critëi de filtro che vëgnan apreuvo: Mus musculus o ven seleçionou comme speçie e sfondo e a categoria a mostra che o valô de P regolou da Benjamini pe l’inricchimento de 0.05 ò ciù basso o l’é tegnuo pe scignificativo. Pe sto grafico vëgne mostrou e çinque categorie ciù erte in eccesso inte ògni gruppo in sciâ base do valô de P regolou. Pe mezo de ciù test t, pe mezo do programma de boost lineare à doe fase de Benjamini, Krieger e Yekutieli (Q = 5%), l’analixi de l’esprescion de proteiñe into corso do tempo a ven fæta in scî candidæ importanti identificæ inte tutte e categorie e tutte e rie vëgnan analizzâ pe conto seu. No gh'é beseugno d'adottâ un SD coerente.
Pe confrontâ i exiti de sto studio co-e banche de dæti pubricæ e generâ un diagramma de Venn inta figua 1, emmo combinou a lista quantitativa de proteiñe con de annotaçioin MitoCarta 2.0 (24). Pe generâ o diagramma deuviæ o strumento in linia Disegna o diagramma de Venn.
Pe de informaçioin into menuo in scê proçedue statistiche deuviæ pe l’analixi proteòmica, se consulta a seçion correspondente de Materiali e metodi. Pe tutti i atri esperimenti, de informaçioin into menuo se peuan attrovâ inta lezzendia ch'a gh'à da fâ. Delongo che no segge speçificou de mainea despægia, tutti i dæti son espressi comme media ± SEM e tutte e analixi statistiche son stæte fæte con deuviâ o programma GraphPad Prism 8.1.2.
Pe di mateiæ in azzonta pe sto articolo, consultâ http://www.
Sto chì o l'é un articolo à accesso averto distribuio a-e condiçioin da liçensa d'attribuçion-no commerciâ de Creative Commons, ch'a permette l'uso, a distribuçion e a reproduçion inte quæ se segge mezzo, basta che l'uso finale o no segge pe guägno commerciâ e a premissa a segge che o travaggio originâ o segge corretto. Referensa.
Nòtta: ti domandemmo solo de fornî o teu indirizzo email de mainea che a persoña ch'o ti recommanda a-a pagina a sa che ti veu che a vedde l'email e ch'o no l'é spam. No cattuemmo nisciun indirizzo email.
Sta domanda a ven deuviâ pe verificâ se ti l'é un vixitatô e pe prevegnî l'invio automatico do spam.
Di E. Motori, I. Atanassov, S. M. V. Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N. G. Larson
L’analixi proteòmica di neuroin disfonçionali a l’à revelou che i programmi metabòlichi vëgnan attivæ pe contrastâ a neurodegeneraçion.
Di E. Motori, I. Atanassov, S. M. V. Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N. G. Larson
L’analixi proteòmica di neuroin disfonçionali a l’à revelou che i programmi metabòlichi vëgnan attivæ pe contrastâ a neurodegeneraçion.
©2020 Assoçiaçion americaña pe-o progresso da sciensa. tutti i driti reservai. AAAS o l'é un compagno de HINARI, AGORA, OARE, CÒRO, ORLOGISS, Referimenti incroxæ e CONTATÔ. I progresci da sciensa ISSN 2375-2548.