Presente†Indirizzo corrente: OX11 0DE, Regno Unio, Edifiçio Diamond, Parco da Sciensa e Innovaçion Harwell, Dietcote, Oxfordshire, Regno Unio, Co.
O complesso 1 ch’o recugge a luxe do çentro de reaçion (RC-LH1) o l’é o componente fotoscintetico do nucleo di battëi fototròfichi cô de moæla. Noemme emmo introduto doe struttue de microcoscopia crioelettrònica do complesso RC-LH1 da rodopseudomona palustris. A struttua à resoluçion de 2,65 Å do complesso RC-LH114-W a consciste de 14 çicli de sottounitæ LH1 che çircondan RC, ch’en interrotti da-a proteiña W, mentre o complesso sensa proteiña-W o l’é completamente unna compoxiçion RC con RC d’in gio. Ciclo LH1 de 16 sottounitæ serrou. O confronto de ste struttue o fornisce de intuiçioin in sciâ dinamica da chinona into complesso RC-LH1, compreiso di cangi conformaçionali indeterminæ in preçedensa quande se liga a chinona into scito RC QB, coscì comme a poxiçion di sciti de ligamme ausiliäi de chinona, che aggiuttan à passâli à RC. A struttua unica da proteiña W a l’impedisce a serratua do çiclo LH1, e donca a crea un cannâ pe accelerâ o scangio chinoña/chinoloña.
L’energia fornia da-a fotoscintexi a peu sostegnî squæxi tutta a vitta in sciâ Tæra e a l’à un gran potençiale pe-e biotecnologie solare. Tanto che promeuvan a fotoscintexi globale, i battëi fototròfichi cô de moæla mostran ascì diverse modalitæ d’energia e capaçitæ metabòliche. Peuan schivâ a fotoscintexi e cresce comme battëi eterotròfichi a-o sciuo, peuan fissâ l’azöto e o bioscido de carbònio, produe l’idrògeno e degraddâ i compòsti aromatichi (1-3). Pe fornî energia pe sti proçesci, a luxe a dev'ëse convertia a-a spedia e de mainea effiçente inte l'energia chimica. Sto proçesso o comensa quande o complesso d’antenna imprexonâ a luxe o sciorbe a luxe e o trasferisce l’energia imprexonâ a-o çentro de reaçion (RC), e donca o comensa a seperaçion da carrega (4 – 7). L’unitæ de base da fotoscintexi inti battëi fototròfichi cô de moæla a l’é compòsta da RC de tipo 2, con un complesso 1 (LH1) ch’o recugge a luxe tutt’in gio, ch’o forma o complesso do nucleo RC-LH1. LH1 o l’é formou da unna matrixe d’eterodimeri αβ curvi, ciaschedun di quæ o liga doe molecole de clorofilla battëia (BChl) e un ò doî carotenòidi (8-12). L’antenna LH1 ciù sencia a consciste inte 16 ò 17 eterodimeri αβ che çircondan RC (9-13) inte un çiclo serrou, ma inte di atri complesci de nucleo, i peptidi trasmembrani interrompan a continuitæ do LH1 ch’o l’à d’in gio, e promeuvendo coscì a diffuxon do chinolo/chinoña e do compòsto bRC1, 13-15). A cianta fototròfica moæla Rhodopseudomonas (Rps.) a l’é un organismo modello ch’o peu capî o trasferimento d’energia e d’elettroin ch’o sostëgne a fotoscintexi. A primma struttua de cristallo de Rps. O modello do complesso RC-LH1 do palustri o l’é RC, con 15 çicli LH1 eterodimerichi tutt’in gio, che son interrotti da unna proteiña desconosciua ciammâ «proteiña W» (14). Dapeu a proteiña W a l’é stæta identificâ comme RPA4402, ch’a l’é unna proteiña no caratterizzâ de 10,5 kDa con træ eliche trasmembrañe previste (TMH) (16). Proponemmo de cangiâ o nomme do gene rpa4402 ch’o codifica a proteiña W inte pufW pe ëse coerente co-a nomenclatua deuviâ pe-i geni che codifican e sottounitæ RC-L, M (pufL, pufM) e LH1α, β (pufA, pufB). Curiosamente, a proteiña W a l’é presente solo che into 10% pöcassæ de RC-LH1, e a revela Rps. palustris o produxe doî complesci RC-LH1 despægi. Chì reportemmo e struttue crio-EM (crio-EM) à erta resoluçion de doî complesci de nucleo, un co-a proteiña W e 14 eterodimeri αβ, l’atro sensa proteiña W e un çiclo serrou con 16 eterodimeri LH1. A nòstra struttua a rappresenta un cangio de passo inta comprenscion do complesso RC-LH1 de Rps. palustris, perché emmo analizzou a popolaçion omogenea de tutte e variante e emmo unna resoluçion ch’abbasta pe assegnâ ciæamente à tutti i peptidi e a-i pigmenti ligæ e a-i lipidi e a-i chinoin correlæ. O confronto de ste struttue o mostra che e træ proteiñe TMH-W che no en stæte attrovæ fin à oua inte nisciun atro complesso RC-LH1 generan un cannâ de chinona pe accelerâ o scangio de chinona/chinona. L’é stæto identificou unna çerta quantitæ de sciti de ligamme di lipidi e de chinone conservæ e emmo revelou un neuvo cangio de conformaçion dòppo a combinaçion de chinone e RC, ch’o peu ëse adatto a-o RC do fotoscistema II (PSII) d’organismi fototròfichi oscigenæ. E nòstre descoverte forniscian de neuve intuiçioin in sciâ cinetica do ligamme e do scangio chinona/chinolona into complesso do nucleo RC-LH1 di battëi fototròfichi cô de moæla.
Pe façilitâ un studio into menuo di doî complesci attrovæ inte Rps. palustris, isoemmo ògni RC-LH1 pe mezo de metodi biochimichi. O complesso con defiçensa da proteiña W (ciammou inte sto chì ΔpufW) o l’é stæto purificou da-o çeppo ch’o no l’à o gene pufW (16) e se peu produe solo che un complesso RC-LH1. O complesso ch’o contëgne a proteiña W o ven produto da un çeppo. A proteiña W de sto çeppo a ven modificâ con un tag His 10x a-o seu termine C, de mòddo che o complesso ch’o contëgne a proteiña W o pòsse vegnî combinou de forma efficaçe co-a ciù parte da proteiña W mancante pe mezo de l’immobilizzaçion do metallo. O complesso o l’é effettivamente separou (16) Cromotografia d’affinitæ (IMAC).
Comme se vedde inta figua 1, tutti doî i complesci contëgnan træ sottounitæ RC (RC-L, RC-M e RC-H) con unn’antenna LH1 tutt’in gio. A struttua 2.80-A do complesso ch’o no l’à a proteiña W a mostra 16 eterodimeri αβ, che forman un çiclo LH1 serrou ch’o l’intorna do tutto o RC, ciammou inte sto chì comme complesso RC-LH116. A struttua de 2,65 Å do complesso ch’o contëgne a proteiña W a l’à un LH1 à 14 eterodimero interrotto da-a proteiña W, ciammou inte sto chì RC-LH114-W.
(A e B) Rappresentaçion de superfiçie do compòsto. (C e D) Pigmenti ligæ espressi inte de bacche. (E e F) I complesci osservæ da-a superfiçie citoplasmatica an i peptidi e e sottounitæ LH1 rappresentæ inti cartoni animæ e en numeræ in senso antioräio da-o gap proteiña-W [coerente co-a numeraçion Rba. complesso di sferòidi (13)]. Pe LH1-α, o cô da sottounitæ da proteiña o l’é giano; pe LH1-β, o cô da sottounitæ da proteiña o l’é bleu; pe-a proteiña-W, a proteiña a l’é rossa; pe RC-H, o l'é cian; pe-o RC-L, o l'é Arancion; pe RC-M, magenta. I cofattoî en representæ da de bastonette, o verde o representa e molecole de BChl e BPh a, o moælo o representa i carotenòidi e o giano o representa e molecole UQ10. (G e H) Vixon ingrandia do spaçio proteiña-W inta region equivalente do complesso RC-LH114-W (G) e do complesso RC-LH116 (H). I cofattoî vëgnan mostræ sotta forma de riempimento do spaçio, a chinona chelâ a vëgne mostrâ in bleu. O spaçio proteiña-W o l’é evidençiou da unna linia trattezzâ bleu inte (G) e i pertuxi piccin donde a chinona/chinololo a se diffonde in sce l’anello LH116 en evidençiæ da unna linia trattezzâ neigra inte (H).
A figua 1 (A e B) a mostra o RC con de matrixe averte ò serræ d’eterodimeri LH1αβ tutt’in gio, ciaschedun di quæ o liga doî BChl e un carotenòide (figua 1, C e D). Di studdi preçedenti an demostrou che Rps o l’é o complesso LH1. Into percorso bioscintetico da xantiña da spiruliña, ste speçie contëgnan de popolaçioin mescce de carotenòidi (17). À tutti i mòddi, a spiropirroxantiña a l’é o carotenòide dominante e a seu denscitæ a soddisfa. De conseguensa, emmo çernou de modellâ a spiroxantiña inte tutti i sciti de ligamme de LH1. I polipeptidi alfa e beta en di TMH senci con de regioin esterne à membraña curta (figua 1, A, B, E e F). Sciben che no s’é osservou a denscitæ de 17 rescidui a-o termine C, o polipeptide alfa o l’é stæto diviso da Met1 à Ala46 inte tutti doî i complesci. O polipeptide β o l’é stæto reduto da Gly4 à Tyr52 inte RC-LH116 e da Ser5 à Tyr52 inte RC-LH114-W. No s’é osservou de denscitæ de 3 ò 4 rescidui N-terminali ò 13 C-terminali (figua S1). L’analixi da spettrometria de massa do complesso mesccio RC-LH1 preparou da-o çeppo de tipo sarvægo a l’à demostrou che a region ch’a mancava a l’ea o resultato da scission eteròloga de sti peptidi (figua S1 e S2). L’é stæto osservou ascì a formilaçion N-terminale de α-Met1 (f). L’analixi a l’à demostrou che o peptide α o consciste da-i rescidui fMet1 à Asp42/Ala46/Ala47/Ala50 e o β-peptide o l’é formou da-i rescidui Ser2 à Ala53, cösa ch’a l’é in bon accòrdio co-a mappa de denscitæ EM à bassa temperatua.
A coordinaçion de α-His29 e β-His36 a rende i BChl faccia à faccia; ògni eterodimero αβ o s’assembla co-i seu vexin pe formâ un çiclo averto (RC-LH114-W) ò un çiclo serrou (RC-LH116) in gio a-o RC A matrixe de pigmenti accobbiæ à l’eçitoin (figua 1, C e D). In confronto a-a banda de 877 nm de RC-LH114-W, o spostamento rosso d’assorbimento de 880 nm de RC-LH116 o l’é de 3 nm (figua 2A). À tutti i mòddi, o spettro do dicroismo riondo o l’é squæxi o mæximo (figua 2B), cösa ch’a l’indica che sciben ch’existe unna differensa ciæa tra i çicli averti e serræ, l’ambiente locale di BChl o s’assumeggia ben ben. O spostamento rosso de l’assorbimento o peu ëse o resultato de un movimento termico reduto e de unna stabilitæ aumentâ in sciô çiclo serrou (18, 19), o cangio inte l’accobbio de pigmenti provocou da-o çiclo serrou (20, 21) ò unna combinaçion de sti doî effetti (11).
(A) Spettro d’assorbimento ultravioletto/vixibile/squæxi infrarosso, e çimme di quæ en marcæ co-i seu pigmenti correspondenti e normalizzæ a-a çimma BPh à 775 nm. (B) Spettro de dicroismo riondo normalizzou à sciorbensa de BChl à 805 nm. (C e D) Spettri ΔA seleçionæ da-i spettri d’assorbimento resòlti into tempo do complesso RC-LH114-W (C) e do complesso RC-LH116 (D). Pe unna megio comparabilitæ, tutti i spettri vëgnan normalizzæ à ∆A de -A à 0.2 ps. (E) O tasso d’oscidaçion do citocromo c2 dòppo l’irradiaçion in presensa de varie conçentraçioin de UQ2 (s’ammie figua S8 pe-i dæti gròsci). (F) Inte çellole cresciue sotta luxe de bassa, media ò erta intenscitæ (10, 30 ò 300 μMm-2 s-1, rispettivamente), e sottounitæ da proteiña W e RC-L into complesso purificou e o rappòrto tra e membrañe separæ. Determinâ o livello de proteiñe pe mezo de l’elettroforexi in sce gel de poliacrilamida SDS e de l’immunoassaggio (s’ammie figua S9 pe di dæti gròsci). Determinâ o rappòrto respetto a-o complesso RC-LH114-W purificou. O rappòrto stechiometrico tra RC-L e proteiña-W do complesso o l’é 1:1.
I BChl inta poxiçion 1 into çiclo αβ14 deformou de RC-LH114-W (figua 1, A, C e E) en ciù vexin a-o donatô primmäio (P) de RC de 6,8 Å che i BChl equivalenti de RC-LH116 (figua 1, figua B e S3); à tutti i mòddi, a cinetica d’assorbimento transitoria di doî complesci a mostra che pe RC-LH114-W e RC-LH116 e constante de tempo de trasferimento d’energia d’eccitaçion da LH1 à RC en de 40 ±4 e 44±3 ps (figua 2). , C e D, figua S4 e tabella S2). No gh'é ascì de differense scignificative into trasferimento elettrònico drento de RC (figua S5 e testo in azzonta correlou). Sospettemmo che a streita correspondensa do tempo de trasferimento d’energia tra LH1 e RC-P a segge dovua a-a distansa, à l’angolo e à l’energia potençiale pægia da ciù parte de BChl inti doî çicli de LH1. Pâ che l'esploraçion do modello d'energia LH1 pe razzonze a distansa minima a no segge ciù spedia che o trasferimento diretto d'energia da di sciti subottimali à RC. O çiclo LH1 à çiclo averto inte RC-LH114-W o peu ascì subî un movimento termico inscignificativo inte condiçioin de bassa temperatua pe l’analixi strutturale e gh’é unna conformaçion d’anello αβ14 ciù longa à temperatua ambiente da-a distansa de pigmentaçion di βBChl inta poxiçion de RC 1.
O complesso RC-LH116 o contëgne 32 BChl e 16 carotenòidi e a seu dispoxiçion complesciva a l’é pægia de quella ottegnua da-o pidpidum do termocromatio (Tch.), da-o straiña de tiorhodovibrio. (12) e æghe verde (Blc.viridis) (ID PDB 6ET5) (10). Dòppo l’allineamento s’é osservou solo de deviaçioin picciñe inte poxiçioin di eterodimeri αβ, mascime 1-5, 15 e 16 (figua S6). A presensa da proteiña W a l’à un impatto scignificativo in sciâ struttua de LH1. I seu trei TMH en collegæ da di çicli curti, co-o terminale N da-a parte do lumen do complesso e o terminale C da-a parte citoplasmatica (figue 1A e 3, da A à D). A proteiña-W a l’é pe-a ciù parte idrofòbica (figua 3B) e TMH2 e TMH3 interagiscian con LH1αβ-14 pe formâ unna superfiçie trasmembraña (figua 3, da B e E à G). L’interfaccia a l’é compòsta pe-o ciù da di rescidui de Phe, Leu e Val inta region trasmembraña. Sti rescidui en ammuggiæ con di aminoaçidi idrofòbichi e di pigmenti αβ-14. Çerti rescidui polari contribuiscian ascì à l’interaçion, compreiso o ligamme idrògeno tra W-Thr68 e β-Trp42 in sciâ superfiçie da cavitæ complessa (figua 3, F e G). In sciâ superfiçie do citoplasma, Gln34 o l’é vexin a-o gruppo cheto di carotenòidi αβ-14. Pe de ciù, a molecola n-dodeçil β-d-maltoscido (β-DDM) a l’é stæta resòlta e a seu coa idrofòbica a s’é esteisa à l’interfaccia tra a proteiña-W e αβ-14, e a coa di lipidi a peu ëse collocâ into còrpo. Noemmo ascì che e regioin de resoluçion C-terminale da proteiña W e RCH en assæ vexiñe, ma no inte l’ambito da formaçion d’interaçioin speçifiche (figua 1, A e E). À tutti i mòddi, peu ësighe de interaçioin inti aminoaçidi C-terminali no resòlti de ste doe proteiñe, che peuan fornî un mecanismo pe-o reclutamento da proteiña-W durante l’assemblaggio do complesso RC-LH114-W.
(A) A proteiña-W, ch’a s’affronta in sce l’interfaccia con LH1αβ14 sotta forma de carton animou, a l’à unna cadeña laterale à forma de verga (rossa), mostrâ inte unna parte do diagramma de potençiale elettrostatico (superfiçie grixa trasparente con un livello de livello de 0.13). (B) Proteiña-W rappresentâ da unna superfiçie de cô idrofòbica. E aree polare e carreghe vëgnan mostræ in cô cian, e aree idrofòbiche in gianco e e aree fortemente idrofòbiche in cô de çetron. (C e D) Proteiña-W rappresentâ into carton animou, o seu orientamento o l’é o mæximo che inte (A) (C) e o l’é rotou de 180° (D). Segondo a poxiçion inta sequensa, i rescidui che se peuan distingue adottan un scistema de cô d’erconçê, donde o terminale N o l’é bleu e o terminale C o l’é rosso. (E) Proteiña-W inta mæxima vixon de (A) e i rescidui à l’interfaccia da proteiña-W:LH1 en representæ da de barre con di segni attaccæ. (F) A proteiña-W a l’é rotâ de 90° respetto à (E) e LH1αβ14 inta representaçion do carton animou e respetto a-i rescidui d’interfaccia inta representaçion à bare. I rescidui che s’arrestan da-o polipeptide beta en marcæ. O cofattô o l’é mostrou comme unna bara ch’a corresponde a-o cô da figua 1, o β-DDM decompòsto o l’é mostrou in grixo e l’oscigeno in rosso. (G) A vixon inte (F) a l’é rotâ de 180°, co-i rescidui prominenti do polipeptide alfa marcou.
A proteiña W a sostituisce un eterodimero αβ (o 15° inta figua 1F), e donca a prevëgne a chiusua do çiclo e l’inclinaçion di primmi trei eterodimeri αβ. S’é osservou che l’angolo d’inclinaçion mascimo do primmo eterodimero αβ-1 respetto a-o normale do cine o l’ea de 25° à 29° (figua 1, A e E), ch’o l’ea formou da l’inclinaçion da 2° à 8° de αβ-1 inte RC A à contrasto netto-LH116 e F (figua 1, B). I segondi e tersi eterodimeri en inclinæ da 12° à 22° e da 5° à 10° rispettivamente. Apreuvo à l’impedimento sterico de RC, l’inclinaçion de αβ-1 a no comprende a segonda cobbia de αβ (ch’a corresponde a-o 16° αβ inta figua 1F), formando coscì unna spaçia ciæa inte l’anello LH1 (figua 1, A e E) . Apreuvo a-a mancansa de doî eterodimeri αβ, accompagnæ da-a perdia de quattro BChl e doî carotenòidi, nisciun di carotenòidi o se liga a-a sottounitæ αβ-1 storta, co-o resultato de un anello LH114-W ch’o contëgne 13 carotenòidi vegetarien e 28 BChl. E stimme de resoluçion locale di doî complesci inte regioin da αβ1 à 7 en ciù basse che quelle do resto do çiclo LH1, cösa ch’a peu riflette a plastiçitæ intrinseca da sottounitæ LH1 vexiña a-o scito RC QB (figua 4).
E figue de RC-LH114-W (A e B) e RC-LH116 (C e D) vëgnan mostræ da-a mæxima vista de d’ato/vista de scianco (A e B) (A e C) e da-a superfiçie da cavitæ da figua 1. (B e D). I tasti de cô son mostræ a-a drita.
L’unico atro complesso caratteristico do nucleo con un rappòrto stechiometrico de 1:14 o l’é o dimero RC-LH1-PufX do rodocòcco sferòide (Rba.) (13). À tutti i mòddi, a proteiña W e PufX no an unn’omologia òvvia e an un impatto scignificativo in scê seu struttue LH1. PufX o l’é un TMH sencio con un dominio citoplasmatico N-terminale ch’o l’interagisce co-a parte citoplasmatica da sottounitæ RC-H (13) inte unna poxiçion ch’a corresponde à Rps. lH116αβ-16. PufX o crea un cannâ pe-o scangio de chinoña/chinoloña tra RC-LH1 e o complesso do citocromo bcl e o l’é presente inte tutti i Rba. complesso do nucleo di sferòidi (13). Sciben che l’interfaccia monòmero-monòmero a l’é inte Rba. O dimero RC-LH1-PufX di sferòidi o s’attreuva inta poxiçion de ligamme da proteiña W inte RC-LH114-W e o gap induto da PufX e da proteiña-W o l’é inte unna poxiçion equivalente (figua S7A). O spaçio inte RC-LH114-W o l’é allinou ascì con l’ipòtetico cannâ de chinoña (8) de Pseudomonas rosea LH1, ch’o l’é formou da di peptidi no ligæ a-a proteiña W ò PufX (figua S7B). Pe de ciù, o cannâ de chinone into Blc. O LH1 verde smeraldo formou con l’escluxon de unna sottounitæ γ (7) o s’attreuva inte unna poxiçion pægia (figua S7C). Sciben che mediou da de proteiñe diverse, a comparsa de sti cannæ de chinoña/chinololo inte unna poxiçion commun into complesso RC-LH1 a pâ ëse un exempio d’evoluçion convergente, cösa ch’a l’indica che o gap creou da-a proteiña W o peu fonçionâ comme cannâ de chinoña.
O spaçio into çiclo LH114-W o permette a formaçion de unna region de membraña continua tra o spaçio interno do complesso RC-LH114-W e a membraña de massa (figua 1G), ciufito che collegâ i doî dominni pe mezo de un pölo de proteiñe comme inte proteiñe. O complesso RC-LH116 o s’assumeggia à un Tch serrou. Complesso à uso ago (22) (figua 1H). Dæto che a diffuxon da chinona atraverso da membraña a l’é ciù spedia che a diffuxon atraverso do cannâ proteico streito, o çiclo LH114-W averto o peu permette un turnover de RC ciù spedio che o çiclo LH116 serrou e a diffuxon da chinona into RC a peu ëse ciù restreita. Pe verificâ se a proteiña W a l’influisce in sciâ converscion de chinoñe pe mezo de RC, emmo fæto un analixi d’oscidaçion do citocromo in sce unna çerta conçentraçion d’ubichinone 2 (UQ2) (un analogo de UQ10 naturale con unna coa d’isoprene ciù curta) (figua 2E). Sciben che a presensa de chinona chelâ a l’impedisce a determinaçion esatta da constante apparente de Michaelis (RC-LH114-W e RC-LH116 en adatti pe 0,2±0,1μM e 0,5±0,2μM rispettivamente), o tasso mascimo de RC-LH1±0,RC114-1 o l’é. 28±5% ciù grande che RC-LH116 (3,6±0,1 e-RC-1 s-1).
A-o comenso emmo stimou che a proteiña-W a l’é presente into 10% pöcassæ do complesso do nucleo (16); chì, i tasci d’occupaçion de çellole de crescita à bassa luxe, à luxe media e à erta luxe en 15±0,6%, 11±1% e 0,9±0,5, rispettivamente % (figua 2F). O confronto quantitativo da spettrometria de massa o l’à demostrou che l’azzonta de un tag d’istidiña a no l’à reduto l’abbondansa relativa de proteiña-W in confronto a-i çeppi de tipo sarvægo (P = 0.59), donca sti livello no son un artefæto de proteiña-W modificâ (figua S10). À tutti i mòddi, sta bassa occupaçion de proteiña-W into complesso RC-LH1 a peu permette à çerti RC de cangiâse à unna lestixe accelerâ, mitigando coscì o scangio ciù lento de chinone/chinolone into complesso RC-LH116. Noemmo l’emmo nottou che l’erto tasso d’occupaçion da luxe o no l’é coerente co-i dæti de trascrittòmica reçenti, cösa ch’a l’indica che l’esprescion genica pufW a l’aumenta sotta unna luxe fòrte (figua S11) (23). A differensa tra a trasmiscion pufW e l’incorporaçion da proteiña-W into complesso RC-LH1 a l’é confusa e a peu riflette a regolaçion complessa da proteiña.
Inte RC-LH114-W vëgne allocou e modellou inte quello 6 cardiolipiña (CDL), 7 fosfatidilcoliña (POPC), 1 fosfatidilglicerölo (POPG) e 29 molecole de β-DDM. RC-LH116 (figua 5, A e B). Inte ste doe struttue, o CDL o s’attreuva squæxi da-a parte citoplasmatica do complesso, mentre o POPC, o POPG e o β-DDM s’attreuvan pe-o ciù da-a parte luminâ. Doe molecole de lipidi e detergente en stæte isoæ inta region da αβ-1 à αβ-6 do complesso RC-LH114-W (figua 5A) e çinque en stæte isoæ inta region equivalente de RC-LH116 (figua 5B). Da l’atro canto do complesso s’é attrovou ciù lipidi, pe-o ciù CDL, ammuggiæ tra RC e αβ-7 à αβ-13 (figua 5, A e B). Di atri lipidi e detergenti con unna resoluçion strutturale s’attreuvan a-o de feua de l’anello LH1 e e cadeñe açile ben resolue s’estenden tra e sottounitæ LH1, designæ provisöiamente comme β-DDM inte RC-LH114-W e definie comme β-DDM inte RC Unna mescciua de βPOPC-DHDM e 166. E poxiçioin che s’assumeggian di lipidi chelanti e di detergenti inta nòstra struttua indican che en di sciti de ligamme fixològicamente relevanti (figua S12A). E poxiçioin de molecole equivalente inte Tch an ascì unna boña coerensa. Gentile e Trv. O çeppo 970 RC-LH1 (figua S12, da B à E) (9, 12) e i rescidui de ligamme idrògeno do gruppo da testa lipidica an mostrou unna conservaçion assæ boña inte l’allineamento de sequensa (figua S13), cösa ch’a l’indica che CDL conservou ch’o se liga à RC (24), sti sciti peuan ëse conservæ inte RCx1.
(A e B) I peptidi RC-LH114-W (A) e RC-LH116 (B) en representæ da di cartoni animæ e i pigmenti da de bacche, deuviando o scistema de cô da figua 1. I lipidi en mostræ in rosso e i detergenti in grixo. UQ ligou a-i sciti RC QA e QB o l’é giano, tanto che UQ isoou o l’é bleu. (C e D) E mæxime vixoin de (A) e (B), co-i lipidi ometti. (E à G) Vixon ingrandia de Q1(E), Q2(F) e Q3(G) da RC-LH116, con de cadeñe laterali che s’influensan l’uña con l’atra. I ligammi idrògeno vëgnan mostræ comme de linie trattezzæ neigre.
Inte RC-LH116, tanto RC QA comme QB UQ, che piggian parte a-o trasferimento d’elettroin into proçesso de seperaçion da carrega, se decompoñan inti seu sciti de ligamme. À tutti i mòddi, inte RC-LH114-W, a chinona QB a no l’é stæta resòlta e a saià trattâ into dettaggio ciù avanti. In azzonta a-i chinöni QA e QB, doe molecole UQ chelæ (che s’attreuvan tra i anelli RC e LH1) vëgnan allocæ inta struttua RC-LH114-W segondo i seu gruppi de testa ben resòlti (s’attreuvan rispettivamente inte Q1 e Q2). spaçio). Figua 5C). Doe unitæ d’isoprene vëgnan assegnæ à Q1 e a mappa de spessixe a resòlve e 10 coe d’isoprene complete de Q2. Inta struttua de RC-LH116 l’é stæto resòlto træ molecole UQ10 chelæ (Q1 à Q3, figua 5D) e tutte e molecole an unna denscitæ ciæa inte tutta a coa (figua 5, D à G). Inte doe struttue, e poxiçioin di gruppi de testa de chinone de Q1 e Q2 an unn’eccellente coerensa (figua S12F) e interagiscian solo che con RC. Q1 o s’attreuva à l’intrâ do spaçio W de RC-LH114-W (figua 1G e 5, C, D e E), e Q2 o s’attreuva vexin a-o scito de ligamme QB (figua 5, C, D) e F). I rescidui de L-Trp143 e L-Trp269 conservæ en assæ vexin à Q1 e Q2 e forniscian de potençiale interaçioin d’impilamento π (figua 5, E e F e figua S12). L-Gln88, 3,0 Å da l’oscigeno distale de Q1, o fornisce un fòrte ligamme idrògeno (figua 5E); sto resciduo o se conserva inte tutti i RC feua che inta relaçion ciù lontaña (figua S13). L-Ser91 o l’é sostituio conservativamente da Thr inta ciù parte di atri RC (figua S13), o l’é 3,8 Angstrom da l’oscigeno metilico de Q1 e o peu fornî di ligammi idrògeno deboli (figua 5E). Q3 o no pâ avei unn’interaçion speçifica, ma o s’attreuva inta region idrofòbica tra a sottounitæ RC-M e a sottounitæ LH1-α da-o 5 a-o 6 (figua 5, D e G). Q1, Q2 e Q3 ò i chinoin chelæ vexin en stæti resòlti ascì inte Tch. Gentile, Trv. Ceppo 970 e Blc. A struttua de l’iride (9, 10, 12) a ponta à un scito de ligamme de chinone ausiliäie conservou into complesso RC-LH1 (figua S12G). I çinque UQ decompòsti inte RC-LH116 son in bon accòrdio co-o 5,8±0,7 de ògni UQ determinou da-a cromotografia à liquidi à erta prestaçion (HPLC), tanto che i trei UQ decompòsti inte RC-LH114-W son ciù basci che O valô mesuou de molecule de 6,2±0,3 o l’indica che no l’é stæto resolto. struttua.
I polipeptidi L e M fäso scimmetrichi contëgnan ciaschedun çinque TMH e forman un eterodimero ch’o combiña un dimero BChl, doî monòmeri BChl, doî monòmeri batteriofaghi (BPh) e un færo no Eme e uña ò doe molecole UQ10. Pe mezo da presensa de ligammi idrògeno in sciô gruppo chetònico terminale e da seu accumulaçion conosciua inte Rps, i carotenòidi vëgnan incorporæ inta sottounitæ M, ch’a piggia o nomme de cis-3,4-deidroorodopiña. Speçie (25). O dominio de membraña esterna de RC-H o l’é ancorou a-a membraña da un TMH sencio. A struttua complesciva do RC a s’assumeggia à quelle de træ sottounitæ RC de speçie affinæ (comme Rba). sferòidi (ID PDB: 3I4D). I macroçicli de BChl e BPh, a scheña carotenòide e o færo no eme se creuvan drento de l’intervallo de resoluçion de ste struttue, coscì comme o gruppo testa UQ10 into scito QA e a chinona QB inte RC-LH116 (figua S15).
A disponibilitæ de doe struttue RC con diversci tasci d’occupaçion do scito QB a fornisce unna neuva opportunitæ d’examinâ i cangi conformaçionali coerenti ch’an da fâ co-o ligamme do chinon QB. Into complesso RC-LH116, a chinona QB a s’attreuva inta poxiçion «proscimale» ligâ do tutto (26), ma a seperaçion de RC-LH114-W a no l’à de chinona QB. No gh’é de chinona QB inte RC-LH114-W, cösa ch’a l’é da mäveggiâse perché o complesso o l’é attivo, ciù tanto che o complesso RC-LH116 co-o chinona QB resòlto strutturalmente. Sciben che i doî anelli LH1 chelan sëi chinoin pöcassæ, çinque en resòlti strutturalmente inte l’anello RC-LH116 serrou, mentre solo che trei en strutturalmente limitæ inte l’anello RC-LH114-W averto. Sto desturbo strutturale aumentou o peu riflette a sostituçion ciù spedia di sciti QB RC-LH114-W, a cinetica ciù spedia da chinona into complesso e l’aumento da probabilitæ d’attraversâ o çiclo LH1. Proponemmo che a mancansa de UQ into scito QB RC de RC-LH114-W a pòsse ëse o resultato de un complesso ciù complesso e ciù attivo, e o scito QB de RC-LH114-W o l'é stæto zeou de botto into turnover de UQ A fase speçifica (l'intrâ into scito QB a l'é stæta serrâ sta conformaçion) ref.
Sensa QB, a rotaçion d’accompagnamento de L-Phe217 inte unna poxiçion ch’a no peu ëse compatibile co-o ligamme de UQ10, perché a provochià unna collixon spaçiale co-a primma unitæ d’isoprene da coa (figua 6A). Pe de ciù, i cangi conformaçionali prinçipæ son òvvi, mascime l’elica de (elica curta into çiclo tra TMH D e E) donde L-Phe217 o vëgne mesciou inta fascia de ligamme QB e a rotaçion de L-Tyr223 (figua 6A) Pe rompî o ligamme idrògeno co-o quaddro de ligamme Q5 e o ligamme M-4. scito (figua 6B). L’elica de pivot a-a seu base, o Cα de L-Ser209 o l’é mesciou de 0.33Å, mentre o L-Val221Cα o l’é mesciou de 3.52Å. No gh’é di cangi che se peuan osservâ inte TMH D e E, che se peuan sorvepoñe inte tutte doe e struttue (figua 6A). Pe quello che semmo, sta chì a l'é a primma struttua into RC naturale ch'a serra o scito QB. Un confronto co-a struttua completa (ligâ à QB) o mostra che primma che o chinone o se reduxe, l’é neçessäio un cangio de conformaçion pe fâlo intrâ into chinone. L-Phe217 o rota pe formâ unn’interaçion π-stacking co-o gruppo testa de chinone e l’elica a se mescia verso l’esterno, permettendo a-o scheletro de L-Gly222 e a-a cadeña laterale de L-Tyr223 de formâ unna ræ de ligammi idrògeno con unna struttua de ligamme idrògeno stabile (figua 6, A e C).
(A) Carton animou sovrapòsto d’ologramma (cadeña L, cadeña à çetron/M, magenta) e struttua apo (grixo), donde i rescidui ciave vëgnan mostræ sotta forma de unna representaçion ch’a s’assumeggia à unna verga. UQ10 o l’é rappresentou da unna bara giana. A linia pontettâ a l’indica i ligammi idrògeno formæ inte tutta a struttua. (B e C) A representaçion da superfiçie de l’apolipoproteiña e de l’intrega struttua de l’anello, con mette in evidensa l’oscigeno da cadeña laterale de L-Phe217 in bleu e L-Tyr223 in rosso rispettivamente. A sottounitæ L a l’é à cô de çetron; e sottounitæ M e H no en de cô. (D e E) Sciti QB de l’apolipoproteiña (D) e intreghi (E) [colore da (A) rispettivamente] e termòfilo termòfilo PSII (verde, bleu con chinona plastica; ID PDB: 3WU2) Allinâ (58).
De mainea inaspëtâ, sciben che gh’é à dispoxiçion diverse struttue de RC con defiçensa de QB sensa LH1, i cangi conformaçionali osservæ inte sto studio no en stæti reportæ in preçedensa. Questi comprendan a struttua d’impoverimento QB da Blc. viridis (ID PDB: 3PRC) (27), Tch. tepido (ID PDB: 1OCCIO) (28) e Rba. sferòidi (ID PDB: 1OGV) (29), che en tutti squæxi pægi a-a seu struttua QB complesciva. Unn’ispeçion attenta de 3PRC a l’à revelou che e molecole de detergente LDAO (òscido de lauril dimetil amina) se ligan à l’intrâ da poxiçion QB, cösa ch’a peu impedî o redispoxiçionamento inte unna conformaçion serrâ. Sciben che o LDAO o no se decompoñe inta mæxima poxiçion inte 1EYS ò 1OGV, sti RC vëgnan preparæ deuviando o mæximo detergente e donca peuan produe o mæximo effetto. A struttua de cristallo de Rba. Pâ che i sferòidi RC co-cristallizzæ co-o citocromo c2 (ID PDB: 1L9B) aggian ascì un scito QB serrou. À tutti i mòddi, inte sto caxo, a region N-terminale do polipeptide RC-M (ch’interagisce co-o scito de ligamme QB pe mezo do ligamme H do resciduo Tyr in sce l’elica Q) a l’adotta unna conformaçion innaturale e o cangio de conformaçion QB o no ven esplorou de ciù (30). Çò ch’o l’é rassicurante o l’é che no emmo visto sta meña de deformaçion do polipeptide M inta struttua RC-LH114-W, ch’a l’é squæxi pægia a-a region N-terminale de RC-LH116 RC. Va dito ascì che dòppo l’eradicaçion de l’antenna LH1 à base de detergente, i RC apolipoproteichi into PDB en stæti resòlti, cösa ch’a l’à eliminou e piscine interne de chinone e i lipidi into spaçio tra o RC e a superfiçie interna de l’anello LH1 ch’o l’à d’in gio (31, 32). RC o l’arresta fonçionale perché o conserva tutti i cofattoî, feua che pe-a chinona QB decompoxibile, ch’a l’é meno stabile e tante vòtte a vëgne persa durante o proçesso de preparaçion (33). Pe de ciù, se sa che a remoçion de LH1 e di lipidi çiclichi naturali da RC a peu avei un impatto in scê fonçioin, comme a duâ de vitta ciù curta do stato P+QB separou da-a carrega (31, 34, 35). Pe quello, s’ipòtexi che l’existensa de l’anello locale LH1 ch’o l’intorna o RC o pòsse mantegnî o scito QB “serrou”, con avvardâ coscì l’ambiente locale vexin a-o QB.
Sciben che l’apolipoproteiña (sensa chinona QB) e a struttua completa representan solo doe istantanee do turnover do scito QB, ciufito che unna serie d’eventi, gh’é di indiçi che o ligamme o peu vegnî serrou pe prevëgnî o religamme da l’idrochinona Pe inibî l’inibiçion do substrato. L’interaçion tra o chinololo e a chinona vexin a-o scito QB de l’apolipoproteiña a peu ëse despægia, cösa ch’a pòrta a-o seu refuo da parte de RC. L’é stæto propòsto da tempo che i cangi conformaçionali zeugan un ròllo into ligamme e inta reduçion di chinoin. A capaçitæ di RC zeæ de redue i chinoin dòppo l’adattamento scuo a l’é compromissa (36); A cristallografia à raggi X a mostra che sto danno o l’é dovuo a-o fæto che i chinoin QB son imprexonæ inte unna conformaçion «distale» à 4,5 Å pöcassæ da-a poxiçion proscimale attiva (26) , 37). Proponemmo che sta conformaçion de ligamme distale a segge unn’istantanea do stato intermedio tra l’apolipoproteiña e a struttua de l’anello completo, ch’o vëgne apreuvo à l’interaçion iniçiale co-a chinona e à l’avertua do scito QB.
O RC de tipo II ch’o s’attreuva into complesso PSII de çerti battëi fototròfichi e cianobattëi, æghe e ciante o l’à unna conservaçion strutturale e fonçionale (38). L’allineamento strutturale mostrou inta figua 6 (D e E) o l’enfatizza a sumeggiansa tra i RC PSII e o scito QB do complesso RC battëio. Sto confronto o l’é stæto pe tanto tempo un modello pe studiâ i scistemi streitamente ligæ de ligamme e reduçion de chinone. De pubricaçioin preçedente an suggerio che i cangi de conformaçion son accompagnæ da-a reduçion de PSII de chinoñe (39, 40). De conseguensa, se se conscidera a conservaçion evolutiva de RC, sto mecanismo de ligamme no osservou primma o peu ëse applicâ ascì a-o scito QB de PSII RC inte ciante fototròfiche oscigenæ.
Rps ΔpufW (deleçion pufW no marcâ) e PufW-His (proteiña-W marcâ con His à termine C espressa da-o locus pufW naturale). palustris CGA009 o l’é stæto descrito into nòstro travaggio preçedente (16). Sti çeppi e o genitô isogenico de tipo sarvægo en stæti repiggiæ da-o congelatô con strisciâ unna quantitæ picciña de çellole in sce PYE (ògni 5 g litro -1) (conservæ inte LB à -80 °C, contegnuo do 50% (p/v) de proteiña de glicerölo), estratto de levou e succinato (% de succinato) agar/w [15]. A placca a l’é stæta incubâ pe-a neutte a-o sciuo à temperatua ambiente inte condiçioin anaeròbiche e dapeu a l’é stæta inluminâ con da luxe gianca (~50 μmolm-2 s-1) fornia da-e lampadiñe à alogeni OSRAM 116-W (RS Components, UK) pe 3 ò 5 giorni fin à quande no l’é compario unna sola colònia. Unna colònia sencia a l’é stæta deuviâ pe inocolâ 10 ml de mezzo M22+ (41) supplementou con di açidi casamino a-o 0.1% (p/v) (ciammæ dapeu M22). A coltua a l’é stæta cresciua inte condiçioin d’oscigeno basso a-o sciuo à 34°C con agitâ à 180 rpm pe 48 oe e dapeu 70 ml da coltua en stæti inocolæ inte mæxime condiçioin pe 24 oe. Unna coltua semiaeròbica con un volumme de 1 ml a ven deuviâ pe inocolâ 30 ml de mezzo M22 inte unna bottiglia de veddro trasparente universale à vite de 30 ml e irradiâ con agitaçion (~50μmolm-2 s-1) pe 48 oe con unna fòrsa magnetica sterile de barra de mescciua. Dapeu 30 ml da coltua en stæti inocolæ con 1 litro pöcassæ de coltua inte mæxime condiçioin, che dapeu en stæti deuviæ pe inocolâ 9 litri pöcassæ de coltua illuminæ à ~200 μmolm-2 s-1 pe 72 oe. E çellole en stæte recuggeite pe centrifugaçion à 7132 RCF pe 30 menuti, resuspeise inte ~10 ml de tris-HCl 20 mM (pH 8,0) e conservæ à -20°C fin à quande gh’é stæto de beseugno.
Dòppo ëse deslenguæ, azzonze di cristalli de desosciribonucleaxi I (Merck, Regno Unio), lisozima (Merck, Regno Unio) e doe comprimæ d’inibitô de proteaxi de l’oloenzima Roche (Merck, Regno Unio) a-e çellole resuspeise. Inte unna çellola de prescion franseise de 20.000 psi (Aminco, USA), e çellole en stæte interrotte da 8 à 12 vòtte. Dòppo avei remposso e çellole ininterrotte e i detriti insolubili pe centrifugaçion à 18.500 RCF pe 15 menuti à 4°C, a membraña a l’é stæta preçipittâ da-o lisou pigmentou pe centrifugaçion à 113.000 RCF pe 2 oe à 43.000°C. Descartâ a fraçion solubile e sospende torna a membraña de cô inte 100-200 ml de tris-HCl 20 mM (pH 8,0) e omogeneizzâ fin à quande no gh’é di aggregæ vixibili. A membraña in sospenscion a l’é stæta incubâ inte 20 mM de tris-HCl (pH 8,0) (Anatrace, USA) ch’o contegniva o 2% (p/v) de β-DDM pe unn’oa a-o sciuo à 4°C con unna mescciua delicata. Dapeu centrifuga à 70°C pe deslenguâ 150.000 RCF à 4°C pe unn’oa pe remeuve i insolubili ch’arrestan.
A membraña solubilizzante do çeppo ΔpufW a l’é stæta applicâ à unna chinòlla de scangio de ioin de sefarösa DEAE de 50 ml con trei volummi de chinòlla (CV) de tampon de ligamme [20 mM tris-HCl (pH 8,0) ch’o contëgne o 0,03% (p/v) de β-DDM]. Lavâ a chinòlla con doî tampoin de ligamme CV e dapeu lavâ a chinòlla con doî tampoin de ligamme che contëgnan 50 mM de NaCl. O complesso RC-LH116 o l’é stæto eluio con un gradiente lineare de NaCl da 150 à 300 mM (inte un tampon de ligamme) in sce 1,75 CV e o complesso de ligamme ch’o l’arrestava o l’é stæto eluio con un tampon de ligamme ch’o contegniva 300 mM de NaCl in sce 0,5 CV. Arrecheugge o spettro d’assorbimento tra 250 e 1000 nm, mantegnî a fraçion co-o rappòrto de sciorbensa (A880/A280) ciù grande de 1 à 880 à 280 nm, diluîlo doe vòtte into tampon de ligamme e deuviâ torna a mæxima proçedua in sciâ chinòlla DEAE In sciâ purificaçion. Diluî e fraçioin con di rappòrti A880/A280 ciù erti che 1,7 e A880/A805 ciù erti che 3,0, exeguî o terso gio de scangio de ioin e conservâ e fraçioin con di rappòrti A880/A280 ciù erti che 2,2 e di rappòrti A880/A805 ciù erti che0.0. O complesso purificou in parte o l’é stæto conçentrou à ~2 ml inte un filtro çentrifugo à limite de peiso molecolare (MWCO) Amicon 100.000 (Merck, Regno Unio) e carregou in sce unna chinòlla d’escluxon de dimenscion Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, Stati Unii) ch’o contegniva un tampon de NaC e 200 ml 1,5 CV. Arrecheugge i spettri d’assorbimento da fraçion d’escluxon de dimenscion e conçentrâ i spettri d’assorbimento con di rappòrti A880/A280 in sce 2,4 e A880/A805 in sce 5,8 à 100 A880 e deuviâli de botto pe-a preparaçion ò l’immagazzinamento da grixella crio-TEM Mantegnî à -80°C.
A membraña solubilizzante do çeppo PufW-His a l’é stæta applicâ à unna chinòlla de sefarösa Ni-NTA FF HisPrep de 20 ml (20 mM de tris-HCl (pH 8,0) ch’a contegniva 200 mM de NaCl e 0,03% (p/p)) inte un tampon IMAC (GECA). v) β-DDM]. A chinòlla a l'é stæta lavâ con çinque CV de tampon IMAC e dapeu con çinque CV de tampon IMAC ch'o contegniva 10 mM d'istidiña. O complesso do nucleo o l’é stæto eluio da-a chinòlla con çinque tampoin IMAC che contegnivan 100 mM d’istidiña. A fraçion ch’a contëgne o complesso RC-LH114-W a ven conçentrâ à ~10 ml inte unna giusterna mescciâ fornia con un filtro Amicon 100.000 MWCO (Merck, UK), diluia 20 vòtte con un tampon de ligamme e dapeu azzonta à 25 ml Into tampon DEAE b in antiçipo. Lavâ a chinòlla con quattro tampoin de ligamme CV, dapeu eluî o complesso in sce eutto CV in sce un gradiente lineare da 0 à 100 mM de NaCl (inte tampoin de ligamme) e i atri quattro CV che contëgnan 100 mM de tampoin de ligamme I complesci rescidui eluæ in sciô sori8A20. ciù erto che 2,4 e o rappòrto A880/A805 ciù erto che 4,6 e fraçioin en stæte conçentræ à ~2 ml inte un filtro çentrifugo Amicon 100.000 MWCO, e impie con 1,5 CV IMAC in antiçipo. 1,5 CV. Arrecheugge i spettri d’assorbimento de fraçioin d’escluxon dimenscion e conçentrâ i spettri d’assorbimento con di rappòrti A880/A280 in sce 2,1 e di rappòrti A880/A805 in sce 4,6 à 100 A880, che vëgnan deuviæ de botto pe-a preparaçion da grixella TEM zeâ ò conservæ fin à -80°C.
Un congelatô à immerscion Leica EM GP o l'é stæto deuviou pe preparâ de grixelle TEM à bassa temperatua. O complesso o l’é stæto diluio inte un tampon IMAC à A880 de 50 e dapeu 5 μl en stæti carregæ in sce unna ræ de rammo revestia de carbònio QUANTIFOIL 1,2/1,3 deschargea da neuva con luxe (Agar Scientific, Regno Unio). Incubâ a grixella à 20°C e 60% d’umiditæ relativa pe 30 s, dapeu ascciugâla pe 3 s e dapeu asmortâla inte de l’etano liquido à -176°C.
I dæti do complesso RC-LH114-W en stæti registræ in sce l’eBIC (Çentro elettrònico de bioimaging) (fonte de luxe de diamanti britannico) con un microscòpio Titan Krios, ch’o fonçioña à unna tenscion d’acceleraçion de 300 kV, con unn’ingrandimento nominale de 130.000 gap de Chose de-2× e un Un quantum GIF Gatan 968 con un rilevatô de çimme K2 o l’é stæto deuviou pe registrâ de immagine in modalitæ de conteggio pe arrecheugge di dæti. A dimenscion do pixel calibrou a l’é de 1,048 Å e o tasso de dòse o l’é de 3,83 e-Å-2s-1. O l'à arrecuggeito o cine inte 11 segondi e o l'à spartio inte 40 parte. Deuviâ l’area revestia de carbònio pe mette a-o çentro torna o microscòpio e dapeu arrecheugge trei cini pe beuggio. Inte l'insemme, l'é stæto arrecuggeito 3130 cini, con di valoî de defocus tra -1 e -3μm.
I dæti pe-o complesso RC-LH116 en stæti arrecuggeiti pe mezo do mæximo microscòpio a-o laboratöio de biostruttua de Asterbury (Universcitæ de Leeds, Regno Unio). I dæti en stæti arrecuggeiti in modalitæ de conto con unn’ingrandimento de 130 k e a dimenscion di pixel a l’é stæta calibrâ à 1,065 Å con unna dòse de 4,6 e-Å-2s-1. O cine o l'é stæto registrou inte 12 segondi e spartio inte 48 parte. Inte l'insemme, l'é stæto arrecuggeito 3359 pellicole, con di valoî de defocus tra -1 e -3μm.
Tutto o trattamento di dæti o l'é fæto into cannâ Relion 3.0 (42). Utilizzâ Motioncorr 2 (43) pe correze o movimento do fascio pe mezo da ponderaçion da dòse e dapeu deuviâ CTFFIND 4.1 (44) pe determinâ o parametro CTF (fonçion de trasferimento de contrasto). E fotomicrografie tipiche dòppo ste fase de elaboraçion de prinçipio vëgnan mostræ inta figua 2. S16. O modello de seleçion automatica o vëgne generou seleçionando à man 250 pixel pöcassæ de 1000 partiçelle inte un quaddro de 250 pixel e nisciuña clascificaçion bidimenscionale (2D) de referensa, refuando coscì quelle clascificaçioin che soddisfan a contaminaçion do campion ò no an de caratteristiche che se peuan distingue. Dapeu l’é stæto fæto unna seleçion automatica in sce tutte e microfotografie e o RC-LH114-W o l’ea de 849.359 partiçelle e o complesso RC-LH116 de 476.547 partiçelle. Tutte e partiçelle seleçionæ an subio doî çircoli de clascificaçion 2D no de referensa e dòppo ògni corsa, e partiçelle ch’incontran l’area de carbònio, a contaminaçion do campion, nisciuña caratteristica òvvia ò de partiçelle che se creuvan fortemente vëgnan refuæ, co-o resultato de 772.033 (90,9%) e 359.657% de clascificaçioin son3d. RC-LH114-W e RC-LH116 rispettivamente. O modello de referensa 3D do comenso o l’é stæto generou pe mezo do metodo da descendensa do gradiente stocastico. Pe mezo do modello de comenso comme referensa, e partiçelle seleçionæ vëgnan clascificæ inte quattro categorie in 3D. Pe mezo do modello de sta categoria comme referensa, fâ unna raffinaçion 3D in scê partiçelle da categoria ciù grande, dapeu deuviâ o filtro passa-basso de 15 Å pe creuve l’area do solvente, azzonze 6 pixel de bordi molli e post-proçessâ i pixel pe correze a fonçion de trasferimento de d’ato de Gatan K2 Mo. Pe-o dataset RC-LH114-W, sto modello de prinçipio o l’é stæto modificou co-a remoçion da fòrte denscitæ in scî bòrdi da maschera (desconnessa da-a denscitæ complessa do nucleo inta Chimera UCSF). I modelli che ne vëgnan (e resoluçioin de RC-LH114-W e RC-LH116 en 3,91 e 4,16 Å rispettivamente) vëgnan deuviæ comme referensa pe-o segondo çiclo de clascificaçion 3D. E partiçelle deuviæ en aggruppæ inta classe 3D de comenso e no contëgnan unna fòrte correlaçion co-o vexinato. Sovrappoxiçion ò mancansa de caratteristiche strutturale òvvie. Dòppo o segondo çircolo de clascificaçion 3D, l’é stæto seleçionou a categoria co-a resoluçion ciù erta [Pe RC-LH114-W, unna categoria a l’é de 377.703 partiçelle (44,5%), pe RC-LH116, gh’é doe categorie, che son allinæ solo che 260.752 partiçelle, dòppo a rotaçion iniçiâ con unna differensa picciña]. E partiçelle seleçionæ vëgnan estræte torna inte unna scatoa de 400 pixel e raffinæ pe mezo da raffinaçion 3D. A maschera solvente a ven generâ pe mezo do filtro passa-basso de 15 Å do comenso, l’espanscion da mappa à 3 pixel e a maschera soft de 3 pixel. Pe mezo do raffinamento do CTF pe partiçella, a correçion do movimento pe partiçella e o segondo çircolo de raffinamento do CTF pe partiçella, o raffinamento 3D, o mascheramento do solvente e o post-proçessamento vëgnan fæti dòppo ògni passo pe raffinâ ancon de ciù a tesciua ch’a ne resulta. Pe mezo do valô de limite FSC (coeffiçente de correlaçion da scheuggioa de Fourier) de 0.143, e resoluçioin di modelli finali de RC-LH114-W e RC-LH116 en 2,65 e 2,80 Å rispettivamente. A curva FSC do modello finale a l'é mostrâ inta figua 2. S17.
Tutte e sequense de proteiñe en telecargæ da UniProtKB: LH1-β (PufB; ID UniProt: Q6N9L5); LH1-α (PufA; ID uniprotificato: Q6N9L4); RC-L (PufL; ID uniProt: O83005); RC-M (PufM; ID uniprot: A0A4Z7); RC-H (PuhA; ID uniprot: A0A4Z9); Proteiña-W (PufW; ID uniproteiña: Q6N1K3). O modello SVISS (45) o l’é stæto deuviou pe costrue un modello d’omologia de RC, ch’o contëgne e sequense de proteiñe de RC-L, RC-M e RC-H e a struttua de cristallo de Rba. sferòidi RC o l’é stæto deuviou comme modello (ID PDB: 5LSE) (46). Utilizzâ o strumento «mappa adattâ» inta Chimera UCSF pe adattâ o modello generou a-a mappa (47), megioâ a struttua da proteiña e o cofattô [4×BChl a (nomme do resciduo da biblioteca de monòmeri = BCL), 2×BPh a (BPH), un ò doî tipi de UQ10 (U10), un no-heme) 3,4-diidròesacarbonilcoliña (QAK)] deuvian Coot (48) pe azzonze. Dæto che QAK o no l’é disponibile inta biblioteca di monòmeri, o l’é stæto parametrizzou pe mezo do strumento eLBOW inte PHENIX (49).
Dapeu l’é stæto costruto a sottounitæ LH1. A-o comenso, o strumento de costruçion automatico inte PHENIX (49) o l’é stæto deuviou pe costrue automaticamente unna parte da sequensa LH1 pe mezo da mappa e e sequense de proteiñe LH1-α e LH1-β comme input. Seleçionâ a sottounitæ LH1 ciù completa, estrâla e carregâla inte Coot, azzonze manualmente a sequensa ch’a ghe manca e raffinâ manualmente a struttua intrega primma d’azzonze doî BCl a (BCL) e unna spirilloxantiña (CRT) [segondo i Rps relevanti A denscitæ do contegnuo de caroten LH1 e o conosciuo. Speçie (17)]. Copiâ a sottounitæ LH1 completa e deuviâ o “Strumento de mappa d’attacco” da Chimera UCSF pe attraccâse inte l’area no modello da denscitæ LH1 ch’a l’é vexiña, e dapeu affinâla inte Coot; repete o proçesso fin à quande tutte e sottounitæ LH1 no son stæte modellæ. Pe-a struttua RC-LH114-W, estraendo a denscitæ no allocâ into Coot, a proteiña a ven segmentâ da-i componenti no proteichi ch’arrestan inta mappa da Chimera USCF e o strumento Autobuild o ven deuviou pe stabilî o modello de comenso e a modellaçion de sottounitæ ch’arrestan (proteiña-W). Into FENICE (49). Azzonze e sequense che mancan a-o modello ch’o ne sciòrte inte Coot (48) e dapeu raffinâ à man a sottounitæ intrega. A denscitæ no allocâ ch’a l’arresta a s’adatta a-a combinaçion di lipidi (ID da biblioteca de monòmeri PDB de CDL = CDL, POPC = 6PL e POPG = PGT), detergente β-DDM (LMT) e molecole UQ10 (U10). Addeuviâ l'ottimizzaçion PHENIX (49) e l'ottimizzaçion manuale inte Coot (48) pe perfeçionâ o modello completo de prinçipio fin à tanto che e statistiche do modello e a qualitæ vixiva da forma no peuan ëse megioæ ancon de ciù. Pe finî, deuviæ LocScale (50) pe affinâ a mappa locale e dapeu exeguisci diversci atri çicli de modellaçion da denscitæ no allocâ e de l’ottimizzaçion automatica e manuale.
I respettivi peptidi, cofattoî e atri lipidi e chinöni ancoræ drento de seu respettive denscitæ vëgnan mostræ inte figue 1 e 2. S18 à S23. E informaçioin statistiche do modello finale son mostræ inta tabella S1.
Delongo che no segge speçificou de mainea despægia, i spettri d’assorbimento UV/Vis/NIR en stæti recuggeiti in sce un spettrofotòmetro Cary60 (Agilent, USA) à di intervalli de 1 nm da 250 nm à 1000 nm e un tempo d’integraçion de 0.1s.
Diluî o campion inte unna cuvetta de quarzo con un percorso de 2 mm pe A880 de 1 e arrecheugge o spettro d'assorbimento tra-i 400 e i 1000 nm. I spettri dicròichi riondo en stæti recuggeiti in sce un spettropolarimetro Jasco 810 (Jasco, Giappon) à di intervalli de 1 nm tra 400 nm e 950 nm con unna lestixe de scanscion de 20 nm min-1.
O coeffiçente d’estinçion molare o l’é determinou co-a diluiçion do complesso do nucleo à un A880 de 50 pöcassæ. Diluî o volumme de 10 μl inte 990 μl de tampon de ligamme ò metanölo e arrecheugge de botto o spettro d’assorbimento pe redue a-o minimo a degraddaçion de BChl. O contegnuo de BChl de tutti i campion de metanölo o l’é stæto carcolou da-o coeffiçente d’estinçion à 771 nm de 54,8 mM-1 cm-1 e o coeffiçente d’estinçion o l’é stæto determinou (51). Dividde a conçentraçion de BChl mesuâ pe 32 (RC-LH114-W) ò 36 (RC-LH116) pe determinâ a conçentraçion do complesso do nucleo, ch'a vëgne dapeu addeuviâ pe determinâ o spettro d'assorbimento do mæximo campion arrecuggeito into coeffiçente d'estinçion do tampon. parallelo. Pe ògni campion l'é stæto piggiou træ mesue repetue e pe-o carcolo l'é stæto addeuviou a sciorbensa media do mascimo Qy de BChl. O coeffiçente d’estinçion de RC-LH114-W mesuou à 878 nm o l’é de 3280±140 mM-1 cm-1, mentre o coeffiçente d’estinçion de RC-LH116 mesuou à 880 nm o l’é de 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 o l’é stæto quantificou segondo o metodo do (52). À dîla curta, a HPLC à fase inversa (RP-HPLC) a l’é stæta fæta pe mezo do scistema HPLC Agilent 1200. Deslenguâ 0,02 nmol pöcassæ de RC-LH116 ò RC-LH114-W inte 50μl de metanölo:cloroformo 50:50 ch’o contëgne o 0,02% (p/v) de cloruro de ferro e iniettâ l’ultrasfera de Beckman Coulter preequilibrâ à mm1 40°C inte un solvente HPLC (metanölo:2-propanölo 80:20) in sce unna chinòlla de ×25 cm. Exeguî l’eluçion isòcratica inte un solvente HPLC pe monitorâ a sciorbensa à 275 nm (UQ10), 450 nm (carotenòidi) e 780 nm (BChl) pe unn’oa. O mascimo into cromatogramma à 275 nm à 25,5 menuti o l’é stæto integrou, ch’o no contegniva nisciun atro compòsto ch’o se poeiva nottâ. L’area intregâ a ven deuviâ pe carcolâ a quantitæ molare de UQ10 estræta con referensa a-a curva de taratua carcolâ da l’inieçion de standard pægi da 0 à 5,8 nmol (figua S14). Ògni campion o l'é stæto analizzou inte træ replicæ e l'errô reportou o corresponde a-o SD da media.
Unna soluçion ch’a contëgne o complesso RC-LH1 con unn’asciorbimento mascimo de Qy de 0.1 a l’é stæta preparâ con 30 μM de citocromo c2 do cheu de cavallo reduto (Merck, Regno Unio) e da 0 à 50 μMUQ2 (Merck, Regno Unio). Trei campioin de 1 ml son stæti inandiæ à ògni conçentraçion de UQ2 e incubæ pe-a neutte into sciuo à 4°C pe garantî un adattamento completo a-o sciuo avanti da mesuaçion. A soluçion a l’é stæta carregâ inte un spettrofotòmetro modulare OLIS RSM1000 fornio con unna grixella de 300 nm à sciamma/linia 500, de fessue d’intrâ de 1,24 mm, de mezo de 0,12 mm e de sciortia de 0,6 mm. Un filtro de passaggio de longhixe 600 nm o l'é misso à l'intrâ do fototubo do campion e do tubo do fotomoltiplicatô de referensa pe escludde a luxe d'eccitaçion. A sciorbensa a l’é stæta monitorâ à 550 nm con un tempo d’integraçion de 0.15 s. A luxe d’eccitaçion a ven emissa da-o LED M880F2 de 880 nm (Thorlabs Ltd., Regno Unio) pe mezo de un cavo à fibra ottica à l’intenscitæ do 90% pe mezo de un contròllo DC2200 (Thorlabs Ltd., Regno Unio) e a ven emissa a-a vivagna de luxe à un angolo de 9°0. O fascio de mesuaçion o s'oppone a-o spegio pe restituî quæ se segge luxe ch'a no l'ea stæta sciorbia da-o campion a-o prinçipio. Monitorâ a sciorbensa 10 s avanti de l’illuminaçion de 50 s. Dapeu a sciorbensa a l’é stæta monitorâ ancon de ciù pe 60 s a-o sciuo pe valuâ a mesua inta quæ o quinolol o redue de forma spontanea o citocromo c23 + (s’ammie figua S8 pe-i dæti gròsci).
I dæti son stæti elaboæ adattando un tasso lineare de comenso drento de 0,5 à 10 s (à segonda da conçentraçion de UQ2) e con fâ unna media di tasci de tutti trei i campioin à ògni conçentraçion de UQ2. A conçentraçion de RC-LH1 carcolâ da-o respettivo coeffiçente d’estinçion a l’é stæta deuviâ pe convertî o tasso inte l’effiçensa catalitica, tracciâ inte Origin Pro 2019 (OriginLab, USA) e adattâ a-o modello Michaelis-Menten pe determinâ i valoî apparenti de Km e Kcat.
Pe-e mesue de sciorbensa transientale, o campion RC-LH1 o l'é stæto diluio à ~2μM inte un tampon IMAC ch'o contegniva 50 mM d'ascorbato de sòdio (Merck, Stati Unii) e 0,4 mM de terbutiña (Merck, Stati Unii). L’açido ascòrbico o ven deuviou comme donatô d’elettroin sacrificâ e o tert-butaclofen o ven deuviou comme inibitô de QB pe fâ de mòddo che o donatô prinçipâ de RC o l’arreste reduto (saieiva à dî no fotooscidou) durante tutto o proçesso de mesuaçion. Pöcassæ 3 ml de campion vëgnan azzonti à unna çellola rotante personalizzâ (diametro 0,1 m pöcassæ, 350 RPM) con unna longhixe de percorso ottico de 2 mm pe fâ de mainea che o campion into percorso laser o l'agge tempo assæ pe l'adattamento scuo tra-i impulsi d'eccitaçion. Addeuviâ di impulsi laser de ~100 fs pe amplificâ o scistema laser Ti: Zaffiro (Spectra Physics, USA) pe eçitâ o campion à 880 nm con unna lestixe de repetiçion de 1 kHz (20 nJ pe NIR ò 100 nJ pe Vis). Avanti d'arrecheugge i dæti, espoñe o campion a-a luxe d'eccitaçion pe 30 menuti pöcassæ. L'espoxiçion a pròvochià l'inattivaçion do QA (eventualmente reduendo o QA unna ò doe vòtte). Ma tegnî presente che sto proçesso o l'é reverscibile perché dòppo un longo periodo d'adattamento scuo, o RC o tornià cian cianin à l'attivitæ de QA. Un spettrometro Helios (scistemi ultraveloçi, USA) o l’é stæto addeuviou pe mesuâ di spettri transientali con un tempo de retardo da -10 à 7000 ps. Utilizzâ o programma Surface Xplorer (Scistemi ultraveloçi, USA) pe desgruppâ i insemmi de dæti e dapeu azzonzeli e standardizzâli. Deuviâ o pacchetto de software CarpetView (Light Conversion Ltd., Lituania) pe deuviâ l’insemme de dæti combinou pe ottegnî di spettri differensiali ligæ a-o decadimento ò deuviâ unna fonçion ch’a l’à da fâ con diversci esponenti co-a respòsta do strumento pe adattâse à l’evoluçion spettrale à longhixe d’onda sencia inte OriginLa (Origin USA).
Comme l’é stæto dito primma (53), l’é stæto preparou un film fotoscintetico ch’o contëgne o complesso LH1 ch’o no l’aiva tanto RC comme antenna LH2 periferica. A membraña a l’é stæta diluia inte di tris 20 mM (pH 8,0) e dapeu carregâ inte unna cuvetta de quarzo con un percorso ottico de 2 mm. Un impulso laser de 30nJ o l'é stæto addeuviou pe eçitâ o campion à 540 nm con un tempo de retardo da -10 à 7000 ps. Elaborâ l’insemme de dæti comme descrito pe Rps. pal campion.
A membraña a l’é stæta pellettâ pe centrifugaçion à 150.000 RCF pe doe oe à 4°C e dapeu a seu sciorbensa à 880 nm a l’é stæta resuspeisa inte 20 mM de tris-HCl (pH 8,0) e 200 mM de NaCl. Deslenguâ a membraña mescciandola a-a lenta inte un β-DDM a-o 2% (p/v) pe unn’oa a-o sciuo à 4°C. O campion o l'é stæto diluio inte 100 mM de carbonato de trietilammònio (pH 8,0) (TEAB; Merck, Regno Unio) à unna conçentraçion de proteiña de 2,5 mg ml-1 (analixi Bio-Rad). Unn’atra elaboraçion a l’é stæta fæta da-o metodo pubricou in passou (54), à comensâ da-a diluiçion de 50 μg de proteiña inte un totale de 50 μl de TEAB ch’o contegniva l’1% (p/v) de laurato de sòdio (Merck, UK). Dòppo a sonicaçion pe 60 s, o l’é stæto reduto con 5 mM de tris(2-carbossetil)fosfiña (Merck, UK) à 37°C pe 30 menuti. Pe l'alchilaçion S, incubâ o campion con 10 mM de metil S-metiltiometansulfonato (Merck, Regno Unio) e azzonzelo da unna soluçion de stock d'isopropanölo de 200 mM pe 10 menuti à temperatua ambiente. A digestion proteolitica a l’é stæta fæta con l’azzonta de 2 μg de mescciua de tripsiña/endoproteiñaxi Lys-C (Promega UK) e incubâ à 37°C pe træ oe. O tensioattivo laurato o l’é stæto estræto con azzonze 50 μl d’açetato d’etile e 10 μl d’açido trifluoroaçetico de qualitæ LC (TFA; Thermo Fisher Scientific, UK) e con vortexâlo pe 60 s. A seperaçion de fase a l’é stæta promossa da-a centrifugaçion à 15.700 RCF pe 5 menuti. Segondo o protocòllo do produttô, l’é stæto deuviou unna chinòlla de spin C18 (Thermo Fisher Scientific, Regno Unio) pe aspirâ con cua e desalâ a fase ciù bassa ch’a contëgne o peptide. Dòppo ëse stæto asciugou pe centrifugaçion à veuo, o campion o l'é stæto deslenguou inte 0,5% de TFA e 3% d'açetonitrilo e 500 ng son stæti analizzæ pe cromotografia RP à nanoflusso insemme a-a spettrometria de massa deuviando i parametri do scistema stæti dettaggiæ in passou.
Deuviâ MaxQuant v.1.5.3.30 (56) pe l’identificaçion e a quantificaçion de proteiñe pe çercâ di Rps. base de dæti do proteöma do palustris. I dæti de proteòmica da spettrometria de massa en stæti depoxitæ inte l’Alliance ProteomeXchange pe mezo do archivio de partenæ PRIDE sotta l’identificatô de dæti PXD020402.
Pe l’analixi pe RPLC insemme a-a spettrometria de massa d’ionizzaçion à elettrospray, o complesso RC-LH1 o l’é stæto preparou da Rps de tipo sarvægo. Pe mezo do metodo pubricou in passou (16), a conçentraçion de proteiñe produta inte çellole de palustri a l’ea de 2 mg ml-1 inte 20 mM de Hepes (pH 7,8), 100 mM de NaCl e 0,03% (p/v) β- (analixi bio-Rad) ) DDM. Segondo o protocòllo do produttô, deuviâ o kit de purificaçion 2D (GE Healthcare, USA) pe estrâ 10 μg de proteiña pe metodo de preçipitaçion e deslenguâ o preçipito inte 20 μl d’açido fòrmico (FA) a-o 60% (v/v), d’açetonitrilo (v/v) a-o 20% e d’ægua (20%) d’ægua. Çinque microlitri son stæti analizzæ pe mezo da RPLC (Dionex RSLC) insemme a-a spettrometria de massa (Maxis UHR-TOF, Bruker). Utilizzâ unna chinòlla MabPac de 1,2×100 mm (Thermo Fisher Scientific, Regno Unio) pe-a seperaçion à 60°C e 100μlmin -1, con un gradiente de 85% (v/v) de solvente A [0,1% (v/v) de FA e 0,02% (v/v) de TFA d’açetonitrilo 90% (v/v)] Pe mezo da vivagna d’ionizzaçion à elettrospray standard e di parametri predefinii pe ciù de 60 menuti, o spettrometro de massa o l’ottëgne da 100 à 2750 m/z (rappòrto massa-carrega). Con l’aggiutto do strumento FindPept do portâ de resòrse pe-a bioinformatica ExPASy, mappâ o spettro de massa a-e sottounitæ do complesso.
E çellole en stæte cresciue pe 72 oe sotta 100 ml de luxe NF bassa (10 μMm-2 s-1), media (30 μMm-2 s-1) ò erta (300 μMm-2 s-1). Medio M22 (medio M22 donde o sorfato d’ammonio o l’é omesso e o succinato de sòdio o l’é sostituio da l’açetato de sòdio) inte unna bottiglia de 100 ml à vitta (23). Inte çinque çicli de 30 s, de perle de veddro de 0.1 micron en stæte perliæ inte un rappòrto de volumme de 1:1 pe lisciâ e çellole e freide in sciâ giassa pe 5 menuti. A matëia ch’a no se soluisce, e çellole no rotte e e perle de veddro en stæte remposse pe centrifugaçion à 16.000 RCF pe 10 menuti inte unna microçentrifuga de banco. A membraña a l’é stæta separâ inte un rotô Ti 70,1 con 100.000 RCF inte tris-HCl 20 mM (pH 8,0) con un gradiente de saccaròsio do 40/15% (p/p) pe 10 oe.
Comme l’é stæto descrito into nòstro travaggio preçedente, l’immunodeteçion do tag His in sce PufW (16). À dîla curta, o complesso do nucleo purificou (11,8 nM) ò a membraña ch’a contëgne a mæxima conçentraçion de RC (determinâ da l’oscidaçion ch’a sottrae o spettro de differensa reduta e ch’a corresponde a-a carrega in sciô gel colorou) inte un tampon de carregamento SDS 2x (Merck, UK) diluio doe vòtte. E proteiñe en stæte separæ in sce unna reprica de gel NuPage bis-tris a-o 12% (Thermo Fisher Scientific, Regno Unio). Un gel o l’é stæto colorou co-o bleu brillante de Coomassie (Bio-Rad, Regno Unio) pe carregâ e visualizzâ a sottounitæ RC-L. A proteiña in sciô segondo gel a l’é stæta trasferia in sce unna membraña de fluoruro de polivinilideno attivou da-o metanòlo (Thermo Fisher Scientific, Regno Unio) pe l’immunoanalixi. A membraña de PVDF a l’é stæta bloccâ inte tris-HCl 50 mM (pH 7,6), NaCl 150 mM, læte scremou in pövea Tween-20 à 0,2% (v/v) e dapeu incubâ con l’anticòrpo primmäio anti-His (inte tampon m5l 7,6), NaCl 150 mM e Tween-20 à 0,05% (v/v)] inte 1:1000 A190-114A, laboratöi de betil, USA) pe 4 oe. Dòppo ëse stæto lavou 3 vòtte pe 5 menuti inte un tampon d’anticòrpo, a membraña a l’é stæta combinâ con un anticòrpo segondäio anti-ratto peroscidaxi de ravanello (Sigma-Aldrich, Regno Unio) (diluio 1:10.000 inte un tampoin d’anticòrpo) Incubâ pe permette a descoerta (5 menuti dòppo 3 lavaggi inte un tampon d’anticòrpo chemiscendo u CESTAR0) (Cyanagen, Italia) e Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Regno Unio).
Disegnando a distribuçion de l'intensitæ de ògni gel colorou ò corsia d'immunoanalixi, integrando l'area sotta a çimma e carcolando o rappòrto d'intenscitæ RC-L (gel colorou) e proteiña-W (immunoanalixi), inte ImageJ (57) Elaborâ l'imagine. Sti rappòrti son stæti convertii inte di rappòrti molari con l'ipòtexi che o rappòrto tra RC-L e proteiña-W into campion puo RC-LH114-W o l'ea 1:1 e con normalizzâ l'insemme de dæti intrego de conseguensa.
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O David J. K. Swainsbury, o Park Qian, o Philip J. Jackson, a Kaitlyn M. Faries, o Dariusz M.
A struttua à erta resoluçion do complesso da trappoa da luxe 1 into çentro de reaçion a fornisce de neuve intuiçioin in sciâ dinamica do chinon.
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©2021 Assoçiaçion americaña pe-o progresso da sciensa. tutti i driti reservai. AAAS o l'é un compagno de HINARI, AGORA, OARE, CÒRO, ORLOGISS, Referimenti incroxæ e CONTATÔ. I progresci da sciensa ISSN 2375-2548.